Trasformazione batterica
Sfondo
All'inizio del XX secolo, la polmonite era responsabile di gran parte dei decessi per malattie infettive1. Al fine di sviluppare un vaccino eff…
All'inizio del XX secolo, un batteriologo britannico di nome Frederick Griffith stava lavorando con il batterio che causa la polmonite Streptococcus pneumoniae. Ha eseguito un semplice esperimento utilizzando due ceppi diversi. Un ceppo è noto come ceppo S a causa di una capsula protettiva che fa apparire lisce le colonie o i grumi che forma e lo rende anche virulento o dannoso. Il secondo era il ceppo R, una versione dei batteri priva della capsula protettiva, che dava alle colonie un aspetto ruvido e le rendeva non virulente.
In primo luogo, Griffith ha preso alcuni dei batteri del ceppo S e li ha riscaldati, producendo una versione uccisa dal calore del ceppo S. Poi, ha raccolto alcuni topi e li ha divisi in quattro gruppi. Iniettò nel primo gruppo il ceppo S virulento e nel secondo il ceppo R non virulento. Ha dosato il terzo gruppo con il ceppo S ucciso a caldo e, infine, ha combinato insieme il ceppo S ucciso a caldo e il ceppo R, e ha iniettato questa miscela nel quarto gruppo. Come previsto, i topi del primo gruppo sono morti e quelli del secondo e del terzo gruppo sono sopravvissuti. Ma con sorpresa di Griffith, anche i topi dell'ultimo gruppo sono morti.
Quando pubblicò il suo studio nel 1928, chiamò questo misterioso processo di trasformazione, poiché ipotizzò la presenza di un principio trasformante sottostante, che permise al ceppo precedentemente non virulento di diventare mortale. Più tardi, nel 1943, Avert, MacLeod e McCarty riferirono che questo principio trasformante era probabilmente l'acido desossiribonucleico, o DNA, che ora sappiamo essere il materiale ereditario. Essenzialmente ciò che è accaduto nell'esperimento di Griffith è stato che quando i batteri sono stati combinati, un po' di DNA è fuoriuscito dal ceppo S ucciso dal calore e nelle cellule del ceppo R, trasformando questi batteri non virulenti e passando le informazioni per creare la capsula protettiva, trasformando il ceppo R in uno virulento, ora in grado di uccidere gli animali del quarto gruppo.
Gli scienziati hanno sviluppato un modo molto più semplice per studiare la trasformazione batterica, utilizzando i batteri E. coli e piccoli anelli circolari di DNA chiamati plasmidi. Di solito, il plasmide utilizzato negli esperimenti di trasformazione include un gene per una funzione speciale, come la resistenza agli antibiotici. Gli E. coli sono un ottimo soggetto per la trasformazione perché possono mostrare una proprietà chiamata competenza, la capacità di assorbire il DNA dall'ambiente. In sostanza, ciò significa che in determinate condizioni ambientali, come una sostanza chimica o uno shock elettrico o termico, la parete cellulare dell'E. coli può diventare temporaneamente permeabile e consentire l'assorbimento del DNA dall'ambiente. Una volta che il plasmide si trova all'interno dell'E. coli, può rimanere nel citoplasma della sua nuova cellula ospite ed essere replicato ed espresso nel corso delle generazioni insieme al genoma, oppure può incorporarsi completamente nel genoma dell'ospite. Se i batteri perdono il plasmide in qualsiasi momento, anche la cellula perderà la sua resistenza agli antibiotici, e quindi gli scienziati coltivano i batteri in un terreno contenente l'antibiotico per garantire che gli unici sopravvissuti siano quelli che contengono il plasmide di interesse.
In questo laboratorio imparerai come trasformare le cellule di E. coli con un plasmide contenente un gene di resistenza agli antibiotici, mentre pratichi tecniche microbiologiche sterili.
All'inizio del XX secolo, un batteriologo britannico di nome Frederick Griffith stava lavorando con il batterio che causa la polmonite Streptococcus pneumoniae. Ha eseguito un semplice esperimento utilizzando due ceppi diversi. Un ceppo è noto come ceppo S a causa di una capsula protettiva che fa apparire lisce le colonie o i grumi che forma e lo rende anche virulento o dannoso. Il secondo era il ceppo R, una versione dei batteri priva della capsula protettiva, che dava alle colonie un aspetto ruvido e le rendeva non virulente.
In primo luogo, Griffith ha preso alcuni dei batteri del ceppo S e li ha riscaldati, producendo una versione uccisa dal calore del ceppo S. Poi, ha raccolto alcuni topi e li ha divisi in quattro gruppi. Iniettò nel primo gruppo il ceppo S virulento e nel secondo il ceppo R non virulento. Ha dosato il terzo gruppo con il ceppo S ucciso a caldo e, infine, ha combinato insieme il ceppo S ucciso a caldo e il ceppo R, e ha iniettato questa miscela nel quarto gruppo. Come previsto, i topi del primo gruppo sono morti e quelli del secondo e del terzo gruppo sono sopravvissuti. Ma con sorpresa di Griffith, anche i topi dell'ultimo gruppo sono morti.
Quando pubblicò il suo studio nel 1928, chiamò questo misterioso processo di trasformazione, poiché ipotizzò la presenza di un principio trasformante sottostante, che permise al ceppo precedentemente non virulento di diventare mortale. Più tardi, nel 1943, Avert, MacLeod e McCarty riferirono che questo principio trasformante era probabilmente l'acido desossiribonucleico, o DNA, che ora sappiamo essere il materiale ereditario. Essenzialmente ciò che è accaduto nell'esperimento di Griffith è stato che quando i batteri sono stati combinati, un po' di DNA è fuoriuscito dal ceppo S ucciso dal calore e nelle cellule del ceppo R, trasformando questi batteri non virulenti e passando le informazioni per creare la capsula protettiva, trasformando il ceppo R in uno virulento, ora in grado di uccidere gli animali del quarto gruppo.
Gli scienziati hanno sviluppato un modo molto più semplice per studiare la trasformazione batterica, utilizzando i batteri E. coli e piccoli anelli circolari di DNA chiamati plasmidi. Di solito, il plasmide utilizzato negli esperimenti di trasformazione include un gene per una funzione speciale, come la resistenza agli antibiotici. Gli E. coli sono un ottimo soggetto per la trasformazione perché possono mostrare una proprietà chiamata competenza, la capacità di assorbire il DNA dall'ambiente. In sostanza, ciò significa che in determinate condizioni ambientali, come una sostanza chimica o uno shock elettrico o termico, la parete cellulare dell'E. coli può diventare temporaneamente permeabile e consentire l'assorbimento del DNA dall'ambiente. Una volta che il plasmide si trova all'interno dell'E. coli, può rimanere nel citoplasma della sua nuova cellula ospite ed essere replicato ed espresso nel corso delle generazioni insieme al genoma, oppure può incorporarsi completamente nel genoma dell'ospite. Se i batteri perdono il plasmide in qualsiasi momento, anche la cellula perderà la sua resistenza agli antibiotici, e quindi gli scienziati coltivano i batteri in un terreno contenente l'antibiotico per garantire che gli unici sopravvissuti siano quelli che contengono il plasmide di interesse.
In questo laboratorio imparerai come trasformare le cellule di E. coli con un plasmide contenente un gene di resistenza agli antibiotici, mentre pratichi tecniche microbiologiche sterili.
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Q1: What was Frederick Griffith's transformation experiment and why was it significant?
Griffith studied two Streptococcus pneumoniae strains: the virulent S strain with a protective capsule and the non-virulent R strain without it. When he combined heat-killed S strain with live R strain and injected mice, they died unexpectedly. This discovery of bacterial transformation in 1928 revealed that genetic material could transfer between bacteria, fundamentally changing our understanding of heredity and laying the foundation for modern genetic engineering.
Q2: How did scientists identify DNA as the transforming principle in Griffith's experiment?
In 1943, Avery, MacLeod, and McCarty demonstrated that the transforming principle was desoxyribonucleic acid, or DNA, the heredity material. They showed that DNA leaked from heat-killed S strain bacteria into R strain cells, carrying genetic information that encoded the protective capsule. This discovery proved DNA was responsible for passing hereditary traits between bacterial cells.
Q3: What are plasmids and why are they useful for bacterial transformation in the laboratory?
Plasmids are small, circular loops of double-stranded DNA found in bacterial cytoplasm that replicate independently from chromosomal DNA. They often carry genes for beneficial traits like antibiotic resistance. Scientists use plasmids as vectors to introduce foreign DNA into bacteria like E. coli because bacteria can easily take in exogenous genetic material and rapidly amplify it, making plasmids ideal tools for genetic engineering research.
Q4: What is bacterial competence and how does it enable DNA uptake?
Competence is the ability of bacteria like E. coli to take up DNA from their environment. Under specific conditions—such as chemical treatment with calcium chloride, electrical shock, or heat shock—the bacterial cell wall becomes temporarily permeable. This allows plasmids and other DNA molecules to cross the membrane and enter the cell, where they can be replicated and expressed alongside the bacterial genome.
Q5: Why do scientists grow transformed bacteria on antibiotic-containing media?
Scientists use antibiotic-containing media as a selection method to identify successfully transformed cells. Plasmids typically carry antibiotic resistance genes, so only bacteria that have taken up the plasmid survive on these plates. Non-transformed bacteria lack the resistance gene and die, ensuring that visible colonies contain the plasmid of interest and have been successfully transformed.
Q6: What happens to a transformed bacterium if it loses its plasmid?
If a transformed bacterium loses its plasmid, it also loses the genes carried on that plasmid, including antibiotic resistance. The cell reverts to its original phenotype and can no longer survive on antibiotic-containing media. This is why continuous selection on antibiotic plates is necessary to maintain populations of successfully transformed bacteria carrying the plasmid of interest.
Q7: How does bacterial transformation using plasmids differ from Griffith's original experiment?
Griffith's experiment involved natural DNA transfer between bacterial strains, while modern bacterial transformation using plasmids is a controlled laboratory process. Scientists artificially introduce recombinant plasmids containing specific genes into competent E. coli cells using heat shock or chemical treatment. This allows precise genetic manipulation and is the foundation for bacterial transformation using plasmids procedure in contemporary genetic engineering and biotechnology research.