Analisi degli enzimi di isolamento e restrizione del DNA

L'estrazione del DNA è la rimozione e la purificazione del DNA dalle cellule. In primo luogo, le cellule vengono lisate - aperte - di solito attraverso una combinazione di distruzione fisica e trattamento con sostanze chimiche, come un detergente che dissolve la cellula e le membrane nucleari. SDS o sodio dodecil solfato è un detergente di uso comune che agisce solubilizzando le proteine e i lipidi che compongono queste membrane. Il contenuto può quindi fluttuare liberamente nella soluzione circostante.

Successivamente, il DNA deve essere separato dalle altre molecole presenti. La proteinasi K aggiunta alla reazione rompe i legami peptidici e digerisce le proteine contaminanti. Il sale viene quindi aggiunto al campione, che stabilizza i gruppi fosfato caricati negativamente nella spina dorsale del DNA e, dopo l'aggiunta di alcol ghiacciato, fa precipitare il DNA fuori dalla soluzione. Il precipitato bianco viene raccolto facendolo girare in una centrifuga dove si deposita sul fondo del tubo. Dopo averlo lavato e risospeso in una soluzione tampone, il DNA estratto può finalmente essere utilizzato in applicazioni di ricerca o biotecnologiche.

Alcune applicazioni biotecnologiche, come l'impronta digitale del DNA, che possono identificare nuovi modelli nel DNA specifici di uno o più individui, comportano l'uso di enzimi di restrizione. Gli enzimi di restrizione sono molecole che interagiscono con il DNA e riconoscono sequenze specifiche. Una volta identificato il loro sito specifico, tagliano il DNA. Ciò comporterà il taglio del filo in uno o più pezzi lineari. Se il DNA estratto era un plasmide, un pezzo circolare di DNA che si trova più spesso nei batteri, qualsiasi taglio comporterà la formazione di uno o più frammenti lineari da parte del DNA. Diversi enzimi di restrizione riconoscono diverse sequenze di DNA, quindi l'utilizzo di una combinazione di questi può portare alla produzione di frammenti distinti.

Nel DNA fingerprinting, possiamo quindi esaminare questi frammenti utilizzando una tecnica chiamata elettroforesi del DNA o gel. Per preparare i gel, l'agarosio in polvere viene mescolato con un tampone e riscaldato fino a quando non si scioglie. Una colorazione nucleotidica viene quindi aggiunta alla miscela calda e quindi questa soluzione viene versata nello stampo di colata. Viene inserito un pettine per formare i pozzetti. Una volta solidificato, il gel viene trasferito in una scatola di gel riempita di tampone e il pettine viene rimosso. Una miscela di riferimento di frammenti di DNA colorato di lunghezze note, la scala del DNA, viene aggiunta a un pozzetto e i campioni di DNA colorato di interesse vengono caricati nei pozzetti rimanenti. La scatola è collegata a una fonte di alimentazione e l'accensione induce la migrazione dei gruppi fosfato caricati negativamente nei nucleotidi del DNA attraverso il gel verso l'anodo, l'estremità positiva. I pezzi più piccoli si muovono più rapidamente dei frammenti più grandi, che migrano con difficoltà.

Al termine della corsa, il gel viene esposto alla luce ultravioletta per visualizzare la colorazione nucleotidica nei campioni di DNA. La loro presenza può essere confermata in base alla loro posizione relativa alle fasce ladder. Poiché il DNA con sequenze diverse avrà siti di taglio in posizioni diverse, questo può produrre nuovi modelli di bande, o impronte digitali, che possono essere utilizzati per distinguere individui o profili di DNA varianti.

In questo laboratorio eseguirai estrazioni di DNA utilizzando un tampone con e senza SDS per valutare l'importanza dei detergenti nell'isolamento del DNA e quindi digerirai il DNA plasmidico con diversi enzimi di restrizione per esaminare i profili di DNA risultanti.