How does mobile phase composition affect compound separation in thin-layer chromatography?

Mobile phase polarity directly influences how far compounds travel on the stationary phase. Pure hexane, an apolar solvent, causes polar compounds like phenol and benzoic acid to move minimally, preventing effective separation. A 60/40 hexane-ethyl acetate mixture, moderately polar, allows compounds to travel farther and space farther apart, enabling better differentiation based on their individual polarities.

What does the Rf value tell you about a compound in TLC?

The Rf value is the ratio of the distance a compound travels from the starting line to the distance the solvent front travels. It quantifies how strongly a compound interacts with the stationary phase relative to the mobile phase. Compounds with lower Rf values have higher affinity for silica gel, while those with higher Rf values interact more strongly with the mobile phase and travel farther.

Why is proper TLC plate handling important before spotting compounds?

TLC plates must be held only by their edges or top with tweezers to prevent damaging or contaminating the silica gel layer. Chips or scratches in the silica gel compromise separation quality and can cause irregular solvent flow. Undamaged plates ensure consistent, reliable results when you apply samples and develop the chromatogram.

How do you identify an unknown compound using reference standards on TLC?

Run the unknown sample alongside reference compounds on the same TLC plate using the same mobile phase. After development and visualization, compare the unknown's spot position and Rf value to those of the reference standards. If the unknown's spot aligns with a reference spot, that compound is present. Multiple spots indicate a mixture of compounds.

What is the purpose of using UV light and iodine vapor to visualize TLC plates?

UV light reveals compounds through fluorescent markers in the silica gel, making spots visible as dark areas against a glowing green background. Iodine vapor creates brown and yellow spots by reacting with organic compounds, providing an alternative visualization method. Using both techniques ensures comprehensive spot detection and accurate compound identification.

Why must the solvent level be below the sample spots when developing a TLC plate?

If the solvent level contacts the spots initially, capillary action will draw solvent directly into the samples, causing them to dissolve and spread excessively. This ruins the separation and makes accurate measurements impossible. Proper solvent positioning ensures samples migrate upward through the stationary phase in a controlled, predictable manner.

How does compound polarity relate to separation on a polar stationary phase?

On polar silica gel, less polar compounds have lower affinity and travel farther, while more polar compounds bind strongly and travel less. Benzoic acid, the most polar compound tested, showed the lowest Rf value, whereas butyl phenyl ether, the least polar, showed the highest. This inverse relationship between polarity and distance traveled enables effective separation and identification.

cromatografia su strato sottile

Concetti Preparazione dell'istruttore Protocollo per Studenti

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La cromatografia su strato sottile, o TLC, è una tecnica utilizzata per separare i composti organici in base alle differenze nelle loro polarità. Ci sono tre componenti di un sistema TLC: la fase stazionaria, il soluto e il solvente di sviluppo.

La fase stazionaria è la superficie su cui verranno separati i composti, che di solito è composta da gel di silice estremamente polare. I composti o miscele analizzati sono i soluti. Le soluzioni diluite dei soluti vengono individuate su un bordo della piastra utilizzando sottili capillari.

Il fondo della piastra viene quindi immerso nel solvente di sviluppo, che di solito è un solvente organico meno polare della fase stazionaria. Il solvente risale la piastra per azione capillare. Quando il solvente passa attraverso le macchie del soluto, porta con sé una parte di ciascun soluto. Questa miscela soluto-solvente è la fase mobile.

La parte superiore della fase mobile è chiamata fronte del solvente. Mentre la fase mobile viaggia lungo la piastra, le molecole di soluto e solvente si attaccano temporaneamente alla fase stazionaria in base alla loro polarità.

I soluti più polari sono fortemente attratti dalla fase stazionaria, quindi si attaccano più spesso e rimangono bloccati per un po'. Meno soluti polari si attaccano meno spesso e non rimangono bloccati a lungo. Ciò significa che un minor numero di soluti polari trascorre più tempo nella fase mobile rispetto a un maggior numero di soluti polari. In altre parole, meno soluti polari viaggiano più velocemente di più soluti polari.

Per ottenere una buona separazione tra i composti, il solvente dovrebbe essere abbastanza polare da spostare il soluto più polare. Ecco alcuni solventi comuni in ordine crescente di polarità. A volte, due solventi vengono combinati per ottenere la polarità desiderata.

Poiché la maggior parte dei composti organici sono bianchi o incolori, le lastre TLC di solito contengono un composto fluorescente. Sotto la luce UV, i composti organici appariranno come macchie scure sulla piastra luminosa.

Una volta visualizzati i composti, è possibile misurare la distanza percorsa e calcolare il fattore di ritardo, o R_f, per ciascuno di essi. Questo valore è la distanza percorsa dal soluto divisa per la distanza totale percorsa dalla fase mobile.

Se il solvente viene scelto correttamente, ogni soluto avrà un R_f nettamente diverso. Questo ci permette di identificare i composti componenti nelle miscele abbinando i valori di R_fai composti noti.

In questo laboratorio, utilizzerai TLC per determinare l'R_f di diversi composti noti, quindi utilizzerai quei valori R_f per determinare l'identità di un composto sconosciuto.

Print Procedure Steps

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonte: Lara Al Hariri e Ahmed Basabrain presso l'Università del Massachusetts Amherst, MA, USA

Effetti della composizione della fase mobile sulla separazione composta
In questa sezione del laboratorio, utilizzerai TLC per confrontare quanto bene l'esano puro e una miscela di esano al 60% e acetato di etile al 40% possono separare fenolo, acido benzoico e butil fenil etere misurando la distanza percorsa dal composto in ciascun solvente.
- Prima di iniziare il laboratorio, indossa un camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti in nitrile. Nota: l'esano e l'acetato di etile sono entrambi volatili, tossici e infiammabili, quindi lavora sempre con loro in una cappa aspirante. Cambia i guanti se vengono utilizzati con del solvente, poiché l'esano e l'acetato di etile permeano i guanti in nitrile in pochi minuti.
- Ora, prendi un tovagliolo di carta e stendilo sul banco. Raccogli con cautela una lastra TLC usando una pinzetta all'estremità della piastra. nota: Tenere sempre le piastre TLC per i bordi o nella parte superiore con una pinzetta per evitare di danneggiare o contaminare il gel di silice.
- Cerca scheggiature o graffi nel gel di silice e procurati una nuova piastra se necessario. Va bene se c'è un po' di scheggiatura a una sola estremità, poiché quella può essere la parte superiore.
- Posiziona il piatto sul tovagliolo di carta nella tua cappa aspirante e appoggia un righello metrico accanto ad esso. Usa una matita di grafite per fare delicatamente un piccolo segno sul gel di silice ~1 cm dalla parte superiore della piastra. Scrivi "100" sulla targa sopra il segno.
- Successivamente, segna delicatamente la piastra 1 cm sopra il fondo su entrambi i lati. Traccia con cura una linea retta tra i segni inferiori per creare la linea di partenza.
- Allora, aggiungi 3 piccoli segni equidistanti sulla linea di partenza con i segni esterni ad almeno 0,5 cm dai lati del piatto. nota: È importante che il gel di silice non sia danneggiato qui, quindi se lo graffi con la matita, prepara un nuovo piatto.
- Ora, traccia il contorno della piastra TLC nel tuo quaderno di laboratorio e copia con precisione i segni sulla piastra. Etichettare i tre marchi come "fenolo", "acido benzoico" e "butil fenil etere". Potresti anche voler etichettare i segni sulla targa stessa.
- Prepara una seconda targa TLC etichettata '60/40' allo stesso modo. Ora, porta le piastre etichettate al banco comune e individua le soluzioni da 1 mg/mL di fenolo, acido benzoico e butil fenil etere nell'etanolo.
- Immergi un capillare pulito in una delle tre soluzioni. Tamponare brevemente e leggermente il capillare esattamente contro l'intersezione tra la linea di partenza e il segno per quel composto. Dovresti individuare due volte per ogni composto.
- Usa lo stesso capillare per individuare la stessa soluzione sulla tua seconda piastra TLC. Le macchie non devono avere un diametro superiore a 2 mm. Quindi, gettare il capillare e chiudere il flaconcino.
- Individua le altre due soluzioni sulle piastre, allo stesso modo, utilizzando capillari puliti. Fare attenzione a non contaminare le soluzioni. NOTA: Se una macchia è molto chiara o molto piccola, attendi che si asciughi, quindi posiziona la stessa soluzione sopra la macchia asciutta. Se la macchia è ancora bagnata, l'azione capillare potrebbe renderla troppo larga e diluita.
- Una volta che hai fatto tre punti su ogni piastra, scarta i capillari e riporta le placche al tuo cappuccio. Tenere i piatti distesi mentre si asciugano.
- Ora, etichetta un barattolo da 50 ml '100% esano' e porta il barattolo, il suo tappo e un cilindro graduato da 10 ml alla cappa del solvente.
- Misura 2 – 3 ml di esano puro con il tuo cilindro graduato e versalo nel barattolo per riempirlo a una profondità di 0,62 – 0,7 cm. Tappa la bottiglia e il barattolo e rimettilo nella tua cappa aspirante.
- Etichetta un secondo barattolo da 50 ml '60% esano, 40% acetato di etile' e portalo insieme a un cilindro graduato pulito alla cappa del solvente. Misurare 2 – 3 ml della miscela 60/40 nel barattolo e rimetterlo nella cappa.
- Posiziona le piastre accanto ai barattoli per confrontare la posizione relativa del solvente e le macchie. Il livello del solvente deve essere inferiore ai punti di ciascuna piastra.
- Allora, prendi tre pezzi di carta da filtro, metti una carta da filtro in posizione verticale contro il muro in ogni barattolo, e poi chiudi bene i barattoli.
- Inizializza ogni piastra sopra il segno in modo da poterle identificare in seguito. Verificare che le carte da filtro nei barattoli siano sature di solvente e che le macchie sulle piastre siano completamente asciutte.
- Ora, apri il barattolo di esano al 100% e usa le pinzette per posizionare delicatamente la piastra 100 nel barattolo, mantenendo la piastra a livello della superficie del solvente mentre entra nel solvente. Chiudete bene il barattolo, facendo attenzione a non urtare il piatto.
- Lascia fermo il barattolo mentre il solvente sale sulla piastra. Lo sviluppo in esano puro richiede solitamente circa 7-10 minuti. Tieni d'occhio la piastra per assicurarti che il solvente non raggiunga la parte superiore.
- Quando il fronte del solvente esano puro è a circa 1 cm dalla parte superiore della piastra, recuperalo usando una pinzetta. Stendilo sul tovagliolo di carta con il gel di silice rivolto verso l'alto e segna rapidamente la parte anteriore del solvente con una linea e una matita sulla piastra. Lasciare la lastra in piano mentre il solvente evapora.
- Posiziona l'altra piastra nell'eluente 60/40 allo stesso modo. Attendere che la parte anteriore del solvente della piastra 60/40 si trovi a circa 1 cm dalla parte superiore, quindi recuperarla e contrassegnare rapidamente la parte anteriore del solvente allo stesso modo.
- Una volta che la piastra in esano al 100% è completamente asciutta, raccoglila con una pinzetta e portala con una matita alla lampada UV sul banco comune.
- Posiziona la piastra sotto la lampada e illuminala con luce UV. La piastra si illuminerà di verde a causa di un pennarello fluorescente nello strato di gel di silice. Le macchie scure sono i composti.
- Delinea attentamente ogni punto a matita, anche se non si sono spostati molto.
- Allora, spegni la lampada e porta la tua piastra nella cappa di sviluppo dello iodio. Aprire la camera di iodio. Usa una pinzetta per posizionare delicatamente la piastra in posizione verticale nella camera dello iodio, quindi copri nuovamente la camera.
- Attendi 3 – 4 minuti affinché il vapore di iodio rimanga nei punti. Quindi, recupera la piastra con una pinzetta, chiudi la camera e delinea le macchie marroni e gialle sulla piastra. Queste macchie sbiadiranno, quindi segnale rapidamente.
- Visualizza la piastra 60/40 secca sotto la luce UV e poi con vapore di iodio allo stesso modo. nota: Per evitare reazioni collaterali, controllare sempre le piastre sotto la luce UV prima di esporle allo iodio.
- Ora, copia con precisione le macchie e i fronti del solvente sui disegni corrispondenti delle piastre nel tuo quaderno di laboratorio. Per ogni piastra, misurare e registrare l'altezza del fronte del solvente rispetto alla linea di partenza.
- Infine, misura la distanza tra il centro di ogni punto e la sua linea di partenza e registrala nel tuo quaderno di laboratorio. Ora puoi passare alla parte successiva del laboratorio.
Identificazione Composta Sconosciuta
Nella seconda metà del laboratorio, utilizzerai le cure amorevoli per scoprire cosa c'è in un analgesico sconosciuto. Potrebbe contenere uno o più di questi composti: aspirina, caffeina e paracetamolo. Questi composti sono altamente polari, quindi utilizzerai una miscela preconfezionata di acetato di etile al 90% ed esano al 10% come eluente.

Eseguirai i tre composti di riferimento e l'ignoto tutti sulla stessa piastra. Successivamente, utilizzerai i valori Rf dei composti di riferimento per identificare l'incognita. Innanzitutto, ricontrolla quale materiale sconosciuto ti è stato assegnato di analizzare prima di iniziare.
- Ora, stendi un tovagliolo di carta pulito nel cappuccio e ottieni una nuova piastra TLC. Prepara il segno superiore e la linea di partenza allo stesso modo di prima. Fare quattro tick equidistanti sul piatto, assicurandosi che i segni esterni siano ad almeno 0,5 cm di distanza dai bordi.
- Disegna una copia esatta della piastra nel tuo quaderno di laboratorio ed etichetta i segni di spunta come 'aspirina', 'paracetamolo', 'caffeina' e 'sconosciuto'.
- Ora, porta il tuo piatto al banco comune. Spot soluzioni di aspirina, paracetamolo, caffeina e l'ignoto che ti è stato assegnato sui segni appropriati utilizzando un capillare pulito per ogni soluzione. nota: Quando si individua la soluzione sconosciuta, non immergere il capillare troppo in profondità nella fiala della soluzione per evitare di ostruire il capillare con materiale insolubile della sostanza sconosciuta.
- Elimina i capillari e chiudi le fiale prima di riportare la piastra nella tua cappa aspirante. Posizionare il piatto su un tovagliolo di carta per completare l'asciugatura.
- Successivamente, etichetta un barattolo pulito da 50 ml con tappo a vite '90% acetato di etile, 10% esano', e portalo in un cilindro graduato pulito alla cappa del solvente.
- Metti 2 – 3 ml della soluzione 90/10 nel barattolo e rimettilo nella tua cappa aspirante. Verificare che il livello del solvente sia al di sotto delle macchie sulla piastra. Quindi, metti una carta da filtro pulita in posizione verticale nel barattolo e chiudilo ermeticamente.
- Una volta che la piastra TLC è asciutta e la carta da filtro è satura, posiziona con cura la piastra nel solvente. nota: È essenziale mantenere la piastra a livello quando si esegue questa operazione. Se il fronte del solvente è diagonale, la distanza percorsa dal solvente sarà diversa per ogni punto, rendendo impossibile confrontare visivamente l'ignoto con i punti di riferimento.
- Attendi che il fronte del solvente raggiunga 1 cm dalla parte superiore della piastra. Quindi, recupera la piastra, contrassegnala con il solvente e lasciala asciugare mentre sei sdraiata.
- Una volta che la lastra è asciutta, visualizzala con la luce UV e nella camera di iodio, e delinea le macchie a matita.
- Il materiale sconosciuto potrebbe essere una miscela di composti, quindi cerca attentamente i punti in linea con tutti e tre i punti di riferimento.
- Allora, copia con precisione le macchie sul disegno della lastra nel tuo quaderno di laboratorio. Misurare e registrare l'altezza del fronte del solvente e i punti rispetto alla linea di partenza.
- Quando hai finito, recupera le carte da filtro sature di solvente dai barattoli e lasciali asciugare nella cappa.
- Versa i solventi avanzati nei rifiuti organici standard, lava la tua vetreria seguendo i metodi abituali del tuo laboratorio e metti via la tua attrezzatura di laboratorio.
- Butta via le lastre TLC usate nella spazzatura del laboratorio o con i rifiuti di vetro, a seconda del materiale di supporto.
- Infine, una volta che i filtri sono asciutti, buttali via insieme a qualsiasi spazzatura rimasta.
Risultati
- Calcola i valori di R_f per fenolo, acido benzoico e butil fenil etere eluito con esano al 100%. Per ogni composto sulla piastra TLC, misurare la distanza dalla linea di partenza al centro del suo punto. Quindi, dividere questo valore per la distanza dalla linea di partenza al fronte del solvente.
- Solo il butil fenil etere si è spostato di una distanza misurabile dalla linea di partenza, il che è coerente con il fatto che è il meno polare. Per una separazione efficace, i valori di R_f dovrebbero differire di 0,3 – 0,7. Quindi, possiamo dedurre che il fenolo e l'acido benzoico sono troppo polari per essere separati efficacemente da un solvente apolare come l'esano puro.
- Calcola i valori R_f per la piastra che hai eseguito in una miscela 60/40 di esano e acetato di etile. L'acetato di etile è un solvente moderatamente polare, quindi i composti hanno viaggiato più lontano e sono più distanziati sulla piastra.
- L'ordine di separazione mostra che l'acido benzoico, il composto più polare, aveva la più alta affinità per il gel di silice, mentre il butil fenil etere, il composto meno polare, aveva la più bassa affinità per il gel di silice. Ciò è coerente con l'ipotesi che meno composti polari viaggiano più lontano nelle fasi stazionarie polari.
- Guarda la tua terza piastra e calcola i valori R_f per aspirina, paracetamolo e caffeina. La caffeina, il complesso più polare dei tre, ha viaggiato di meno. Il paracetamolo ha viaggiato il secondo più lontano, mentre l'aspirina, il meno polare, ha viaggiato di più.
- Infine, identifica i composti nel tuo materiale sconosciuto confrontando il suo punto o i suoi punti con i tre punti di riferimento.

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