33.4: Microscopia ad immunofluorescenza

Un microscopio a fluorescenza utilizza cromofori fluorescenti chiamati fluorocromi, che possono assorbire energia da una sorgente luminosa e quindi emettere questa energia come luce visibile. I fluorocromi includono sostanze naturalmente fluorescenti (come le clorofille) e coloranti fluorescenti che vengono aggiunti al campione per creare contrasto. Coloranti come il Texas Red e il FITC sono esempi di fluorocromi. Altri esempi includono i coloranti dell’acido nucleico 4’,6’-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e l’arancio di acridina.

Il microscopio irradia il campione con eccitazione a lunghezza d'onda corta, come la luce ultravioletta o blu. I cromofori assorbono la luce di eccitazione ed emettono luce visibile con lunghezze d'onda maggiori. La luce di eccitazione viene quindi filtrata (in parte perché la luce ultravioletta è dannosa per gli occhi) in modo che solo la luce visibile passi attraverso la lente oculare, producendo un'immagine del campione con colori vivaci su uno sfondo scuro.

I microscopi a fluorescenza possono identificare agenti patogeni, trovare specie particolari all'interno di un ambiente o trovare la posizione di particolari molecole e strutture all'interno di una cellula. Sono stati sviluppati anche approcci per distinguere le cellule vive da quelle morte in base al fatto che assorbono particolari fluorocromi. A volte, vengono utilizzati più fluorocromi sullo stesso campione per mostrare strutture o caratteristiche diverse.

Una delle applicazioni più importanti della microscopia a fluorescenza è l'immunofluorescenza, che viene utilizzata per identificare determinati microbi osservando se gli anticorpi si legano a loro. (Gli anticorpi sono molecole proteiche prodotte dal sistema immunitario che si attaccano a specifici agenti patogeni per ucciderli o inibirli). Questa tecnica ha due approcci: test di immunofluorescenza diretta (DFA) e test di immunofluorescenza indiretta (IFA). Nel DFA, gli anticorpi specifici (ad esempio, quelli che prendono di mira il virus della rabbia) sono colorati con un fluorocromo. Se il campione contiene l'agente patogeno bersaglio, è possibile osservare gli anticorpi che si legano all'agente patogeno al microscopio a fluorescenza. Questa è una colorazione anticorpale primaria perché gli anticorpi colorati si attaccano direttamente all'agente patogeno.

Nell'IFA, gli anticorpi secondari sono colorati con un fluorocromo anziché con gli anticorpi primari. Gli anticorpi secondari non si attaccano direttamente all'organismo ma si legano agli anticorpi primari. Quando gli anticorpi primari non colorati si legano al patogeno, si può osservare che gli anticorpi secondari fluorescenti si legano agli anticorpi primari. Pertanto, gli anticorpi secondari si attaccano indirettamente all'agente patogeno. Poiché più anticorpi secondari possono spesso attaccarsi a un anticorpo primario, l'IFA aumenta il numero di anticorpi fluorescenti attaccati al campione, facilitando la visualizzazione delle sue caratteristiche.

This text is adapted from Openstax, Microbiology 2e, Section 2.4: Staining Microscopic Specimens.

Nella microscopia a immunofluorescenza, gli anticorpi marcati con fluorofori emettono fluorescenza dopo aver legato un bersaglio specifico o un antigene.

La microscopia a immunofluorescenza utilizza la luce per eccitare gli elettroni del fluoroforo a uno stato energetico più elevato. Quando tornano allo stato fondamentale, gli elettroni rilasciano una lunghezza d'onda della luce più lunga.

Questa emissione o fluorescenza consente la visualizzazione di cellule specifiche all'interno dei tessuti o di particolari proteine all'interno delle cellule.

L'immunofluorescenza può essere diretta quando l'anticorpo primario marcato con fluoroforo si lega alla proteina bersaglio. Oppure, può essere indiretto, in cui gli anticorpi secondari marcati con fluorofori legano uno specifico anticorpo primario attaccato alla proteina di interesse. La fluorescenza risultante è più forte di quella emessa dall'immunofluorescenza diretta.

L'immunofluorescenza diretta viene utilizzata per rilevare l'aggregazione proteica anomala nei tessuti, mentre l'immunofluorescenza indiretta può rilevare gli anticorpi circolanti nel siero durante la diagnosi di malattia autoimmune.