33.4: Microscopia a immunofluorescenza

Un microscopio a fluorescenza utilizza cromofori fluorescenti chiamati fluorocromi, che possono assorbire energia da una fonte di luce e quindi emettere questa energia come luce visibile. I fluorocromi includono sostanze naturalmente fluorescenti (come le clorofille) e coloranti fluorescenti che vengono aggiunti al campione per creare contrasto. Coloranti come il rosso Texas e il FITC sono esempi di fluorocromi. Altri esempi includono i coloranti dell’acido nucleico 4′,6′-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e l’arancio acridina.

Il microscopio irradia il campione con un’eccitazione a lunghezza d’onda corta, come la luce ultravioletta o blu. I cromofori assorbono la luce di eccitazione ed emettono luce visibile di lunghezze d’onda più lunghe. La luce di eccitazione viene quindi filtrata (in parte perché la luce ultravioletta è dannosa per gli occhi) in modo che solo la luce visibile passi attraverso la lente oculare, producendo un’immagine del campione in colori vivaci su uno sfondo scuro.

I microscopi a fluorescenza possono identificare agenti patogeni, trovare particolari specie all’interno di un ambiente o trovare le posizioni di particolari molecole e strutture all’interno di una cellula. Sono stati inoltre sviluppati approcci per distinguere le cellule viventi da quelle morte in base al fatto che assorbano particolari fluorocromi. A volte, più fluorocromi vengono utilizzati sullo stesso campione per mostrare strutture o caratteristiche diverse.

Una delle applicazioni più importanti della microscopia a fluorescenza è l’immunofluorescenza, che viene utilizzata per identificare determinati microbi osservando se gli anticorpi si legano ad essi. (Gli anticorpi sono molecole proteiche prodotte dal sistema immunitario che si attaccano a specifici agenti patogeni per ucciderli o inibirli.) Questa tecnica ha due approcci: saggio di immunofluorescenza diretta (DFA) e saggio di immunofluorescenza indiretta (IFA). Nella DFA, gli anticorpi specifici (ad esempio, quelli che hanno come bersaglio il virus della rabbia) sono colorati con un fluorocromo. Se il campione contiene l’agente patogeno mirato, è possibile osservare gli anticorpi che si legano all’agente patogeno al microscopio a fluorescenza. Questa è una colorazione anticorpale primaria perché gli anticorpi colorati si attaccano direttamente all’agente patogeno.

Nell’IFA, gli anticorpi secondari sono colorati con un fluorocromo piuttosto che con anticorpi primari. Gli anticorpi secondari non si legano direttamente all’organismo, ma si legano agli anticorpi primari. Quando gli anticorpi primari non colorati si legano all’agente patogeno, si può osservare che gli anticorpi secondari fluorescenti si legano agli anticorpi primari. Pertanto, gli anticorpi secondari sono attaccati indirettamente all’agente patogeno. Poiché più anticorpi secondari possono spesso legarsi a un anticorpo primario, l’IFA aumenta il numero di anticorpi fluorescenti attaccati al campione, facilitando la visualizzazione delle sue caratteristiche.