Qui si descrivono i metodi elettrofisiologici per la misurazione della trasmissione sinaptica a livello della giunzione neuromuscolare larva di Drosophila. Rilascio evocato è iniziata artificialmente stimolando gli assoni dei motoneuroni, e la trasmissione attraverso il NMJ può essere misurata la risposta postsinaptica evocata nel muscolo.
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Articolo metodologico
Metodi elettrofisiologici per la registrazione Potenziali Synaptic dal NMJ Larve di Drosophila
In questo articolo
Sommario
Abstract
In questo video, si descrivono i metodi elettrofisiologici per la registrazione, la trasmissione sinaptica a livello della giunzione neuromuscolare (NMJ) larva di Drosophila. Il sistema larvale neuromuscolare è una sinapsi modello per lo studio della fisiologia e la neurotrasmissione sinaptica, ed è un valido strumento di ricerca che ha definito la genetica ed è accessibile alla manipolazione sperimentale. Larve possono essere sezionato per mostrare il corpo muro muscolatura, sistema nervoso centrale, e dei nervi periferici. I muscoli di Drosophila e il loro modello di innervazione sono ben caratterizzati e muscoli sono di facile accesso per la registrazione intracellulare. Singoli muscoli possono essere identificati dalla loro posizione e l'orientamento all'interno degli 8 segmenti addominali, ciascuno con 30 muscoli disposti in uno schema che si ripete in segmenti A2 - A7. Sezionato larve drosofila sono i muscoli sottili e individuali e fasci di assoni dei neuroni motori possono essere visualizzati con transilluminazione
Protocollo
Prima di iniziare la preparazione:
- Vagando yhird instar Drosophila larve
- HL3.1 (Modificata emolinfa-like) soluzione
- Sylgard (gomma siliconica trasparente) dissezione piatti preparati in piccolo (35 x 10 mm) scatole Petri in plastica usando i metodi descritti da Brent e McCabe (2008) 3.
- Tagliare perni dissezione breve
- Stimolare pipette elettrodo
- Pipette di registrazione Sharp
HL3 Soluzione:
- Durante dissezioni ed esperimenti elettrofisiologici, larva sono immersi in HL3.1 soluzione 2 che contiene (in mm): 70 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, ....
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Discussione
I metodi descritti qui forniscono un modo relativamente rapido e ampio per rilevare i cambiamenti nella funzione sinaptica alla NMJ. La possibilità di effettuare registrazioni elettrofisiologiche su animali intatti in vivo, ed eseguire manipolazioni genetiche o farmacologiche, fanno Drosophila un modello animale ideale per indagare gli aspetti fisiologici e genetici della neurotrasmissione.
Dato che le cellule muscolari sono molto grandi, qualcuno potrebbe preferire di aggiungere un ulterior.......
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre di Petri piccole (35 x 10 mm) | BD Biosciences | 1008 | |
| Kit per elastomero di silicone SYLGARD 182 | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Microscopio stereoscopico | Carl Zeiss, Inc. | 475002-9902 | |
| Sorgente luminosa per microscopio | Schott AG | KLI500 | |
| Puntine da dissezione | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Software pClamp 9 | Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | |
| Forbici da dissezione: forbici a molla Vannas da 3 mm | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Pinzette Dumont SS | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Pinzette Dumont n. 5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capillari di vetro borosilicato con pareti sottili, con filamento (1,0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Capillari di vetro borosilicato, con filamento (1,2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | |
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | |
| Lucidatrice per pipette | Narishige International | MF-83 | |
| Testa amplificatrice Axon HS-2A | Molecular Devices | Model HS-2A | |
| Micromanipolatori | Sutter Instrument Co. | MP-85 | |
| Amplificatore Axoclamp 2B | Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | |
| Software Clampex | Molecular Devices | v 8.2.0.235 | |
| Software Mini analysis, v 6.0.3 | Synaptosoft | ||
| Amplificatore di precisione Brownlee | Brownlee | Model 410 | |
| NaCl | Baker/VWR | 4058-01 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | p-9333 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | s6297-1kg | |
| Trelahose | Sigma-Aldrich | TO167 | |
| Saccarosio | Fisher Scientific | bp220-212 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | h-3375 | |
| MgCl-6H2O | Sigma-Aldrich | m2670-1kg | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | c79-500 | |
| Generatore di impulsi Master-8 | A.M.P.I | ||
| Tavolo antivibrazioni per configurazione di elettrofisiologia | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Gabbia di Faraday |
Riferimenti
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F.
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Ristampe e permessi
