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Prima di iniziare la preparazione:
- Vagando yhird instar Drosophila larve
- HL3.1 (Modificata emolinfa-like) soluzione
- Sylgard (gomma siliconica trasparente) dissezione piatti preparati in piccolo (35 x 10 mm) scatole Petri in plastica usando i metodi descritti da Brent e McCabe (2008) 3.
- Tagliare perni dissezione breve
- Stimolare pipette elettrodo
- Pipette di registrazione Sharp
HL3 Soluzione:
- Durante dissezioni ed esperimenti elettrofisiologici, larva sono immersi in HL3.1 soluzione 2 che contiene (in mm): 70 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 trealosio, 115 saccarosio, e 5 HEPES, pH 7,2.
- Le concentrazioni di CaCl 2 si aggiungono alla soluzione HL3.1 di fornire la necessaria concentrazione extracellulare di Ca 2 +.
- Dissezioni larvali vengono eseguiti a basse concentrazioni di Ca 2 + (per evitare la contrazione muscolare) utilizzando HL3.1 + 0,25 mM CaCl 2, tenuta in ghiaccio.
- Esperimenti elettrofisiologici sono in genere registrati in HL3.1 + 1 mM CaCl 2, ma questa può essere regolata 0,4-1 mM Ca 2 + come richiesto.
- La soluzione è HL3.1 filtro sterilizzati prima dell'uso, e conservati a 4 ˚ C.
Preparazione di stimolare e pipette di registrazione:
- Pipette di registrazione e stimolanti sono tirati con un P-2000 Sutter estrattore basato Laser micropipetta utilizzando le seguenti impostazioni: calore = 390, Filament = 4, Velocità = 35, Delay = 200 e Pull = 0.
- Elettrodi stimolanti sono preparati con pareti sottili capillari in vetro borosilicato con estremità ampia che erano leggermente più grande della larghezza della assoni motori reciso. Le estremità sono a forma di firepolished per dare una finitura liscia (utilizzando una pipetta Narashiga lucidatore), per minimizzare i danni al nervo. Elettrodi stimolanti sono riempite con soluzione bagno (HL3.1 + 1 mM Ca 2 +).
- Gli elettrodi di registrazione sono preparati da 1,2 millimetri di vetro borosilicato, che viene prelevata per formare una pipetta acuto (30-60 mΩ), e riempito di KCl 3M.
Parte 1: dissezione di larve di Drosophila
- Terzo larve instar erranti sono sezionato per mostrare i muscoli nella parete del corpo come descritto in precedenza 4.
- Dissezioni sono eseguite in HL3.1 + 0,25 mM Ca 2 + su lastre di silicone piccolo (35 x 10 mm). HL3.1 soluzione deve essere ghiacciata per dissezioni al fine di anestetizzare la larva, e viene mantenuto in ghiaccio prima e durante la dissezione.
- Le larve sono sezionati utilizzando i metodi descritti da Brent e McCabe (2008), che viene modificato per gli esperimenti di elettrofisiologia con l'aggiunta di 0,25 mm Ca 2 + alla soluzione HL3.1 dissezione, e con perni dissezione breve (circa 2 mm di lunghezza) che sono meno probabilità di colpire l'obiettivo microscopio e gli elettrodi durante un esperimento.
- A seguito di dissezione, gli assoni motori delle larve sono interrotti. Questo viene fatto delicatamente tenendo il sistema nervoso centrale e alzando leggermente in modo da i nervi periferici che innervano i muscoli posteriori del ganglio ventrale può essere tagliata senza danneggiare i muscoli (Figura 1). Il cervello viene quindi rimosso.
- La preparazione larvale sezionato viene lavato due volte con HL3.1 + 1 mM Ca 2 +.
Figura 1. Schematica che mostra i passaggi necessari per il taglio del assoni motori di larve sezionato. La CNS è sollevato con una pinza e gli assoni motori sono tagliati alla base del cervello.
Parte 2: le registrazioni intracellulari da cellule muscolari larvale.
- Posizionare la piastra di dissezione sul microscopio elettrofisiologia e sommergere la preparazione con HL3.1 + 1,5 mM Ca 2 + e fissare l'elettrodo in modo da bagno è in contatto con la soluzione.
- Tutti gli esperimenti vengono eseguiti su muscoli 6 anni entro il terzo segmento addominale (A3). Nervi periferici che innervano i muscoli sono stimolati utilizzando un elettrodo di aspirazione 5.
- Posizionare l'elettrodo stimolante il primo piatto per evitare vibrazioni quando l'elettrodo intracellulare è a posto. Posizionare l'elettrodo stimolante in prossimità del neurone motore innervano muscoli 6 e applicare delicata aspirazione fino a quando il nervo taglio è all'interno della pipetta di vetro. Fare attenzione a non allungare i nervi quando l'aspirazione viene applicata. Sollevare la pipetta leggermente in modo che non tocchi il muscolo e posizionarla in modo che non è tirando le fibre nervose taglio (Figura 2).
Figura 2. Uno schema della muscolatura e motoneuroni innervano di un segmento addominale dalla larva di Drosophila. La posizione della pipetta stimolante e reciso i nervi e l'elettrodo di registrazione in posizione muscolare 6 sono illustrati. - Intraregistrazioni cellulari sono realizzate con i microelettrodi affilato pieno di 3 M KCl. Posizionare l'elettrodo di registrazione sopra il centro del muscolo 6 sul terzo segmento addominale (A3) e regolare l'ingresso di offset in modo che legga zero per la soluzione del bagno. Abbassare lentamente l'elettrodo e l'approccio al muscolo sotto alto ingrandimento ottico fino a toccare la superficie del muscolo. Guarda l'oscilloscopio per confermare che il muscolo è stato penetrato. Il potenziale di membrana a riposo deve essere di almeno -60 mV, o l'animale non deve essere utilizzato. Sporadici potenzialità placca in miniatura dovrebbe essere visibile. Lasciare la cella di stabilizzare per un minuto prima di iniziare a registrare.
- Variazioni del potenziale di membrana vengono rilevati con un HS-2A stadio testa Axon e un amplificatore 2B Axoclamp e registrato con CLAMPEX v 8.2.0.235 (Axon Instruments). La 2B Axoclamp è interfacciato con un computer che esegue software pCLAMP e lavora in congiunzione con l'interfaccia Digidata 1322A.
- Le cellule sono state registrate per 3 minuti senza nessuno stimolo a misurare le risposte mEJP. Le tracce sono state analizzate utilizzando un software di analisi Mini (Synaptosoft, v 6.0.3) e l'ampiezza e la frequenza mEJP determinato.
La stimolazione del nervo:
- La fine reciso del neurone motore viene stimolato con una serie di impulsi di tensione quadrati (0,3 ms di durata) con un'intensità che è sufficiente per entrambe le assoni motori, per evocare risposte coerenti in tutto il muscolo.
- Lo stimolo viene generato con il Maestro-8 generatore di impulsi, che è programmato per fornire impulsi continuamente a seconda della durata e tempi di intervallo.
- Lasciate cinque secondi tra gli stimoli per il recupero sinaptico al NMJ.
- Nel determinare l'intensità dello stimolo, iniziare con il più basso livello e aumentare l'intensità lentamente diverse prove. L'intensità dello stimolo minimo che si traduce in una risposta evocata deve essere utilizzato negli esperimenti.
- Quando l'intensità dello stimolo appropriato è raggiunto, ci dovrebbe essere una EJP composto e una contrazione muscolare evocata dallo stimolo.
- Record di almeno 10 potenziali evocati da ogni muscolo e media le ampiezze.
Parte 3: Risultati Rappresentante
Figura 3. Rappresentante registrazione intracellulare dal muscolo 6 mostra la evocato EJP è risposta alla stimolazione elettrica del nervo segmentale, e le potenzialità sporadici placca in miniatura, o di mEJP. Ampiezze EJP nel muscolo 6 di sano wild-type larve, come il Canton S, sono in genere circa 40 mV e le ampiezze mEJP tra 1-3 mV.