Misura Caenorhabditis elegans Life Span su terreni solidi

Sommario

In questo articolo vi presentiamo un protocollo generale per la misurazione della durata di nematodi mantenuto su un supporto solido con UV ucciso cibo batterica.

Abstract

L'invecchiamento è un processo degenerativo caratterizzato da un progressivo deterioramento delle componenti cellulari e gli organelli con conseguente mortalità. Il nematode

Protocollo

Parte 1: Preparare nematode crescita media (NGM) piastre

Questa sezione descrive la preparazione dei piatti NGM solido per l'uso nella sperimentazione durata della vita. Un esperimento di base durata della vita richiede due tipi di piastre: piastre NGM standard, che non contengono additivi, e Amp / FUDR piatti, che hanno entrambi ampicillina (Amp) e fluorodeoxyuridine (FUDR) aggiunto al NGM. L'ampicillina è usata per prevenire la contaminazione batterica stranieri. FUDR inibisce la divisione cellulare, riduce la produzione di uova, e previene le uova da cova. L'uso di FUDR per l'analisi longevità non influisce durata vita adulta ed elimina la necessità di trasferire i vermi ogni pochi giorni al fine di separarli dalle larve in crescita. Entrambi i tipi di piastre sono seminati con E. coli OP50 batteri, che viene successivamente ucciso da esposizione ai raggi UV.

1. Preparare NGM (vedi sezione 5 per ricetta e le note di stoccaggio) e piastre Petri etichetta. Avrete bisogno di 1 60 mm Piastra di Petri per 10 ml di NGM. Se si inizia con NGM solido precedentemente preparato, passare al punto 1.2. Se si inizia con NGM appena sterilizzati in autoclave, passare al punto 1.4.
2. Completamente sciogliere NGM solido microonde in alto di 30 impulsi secondo. Mezzi di turbolenza tra gli impulsi per evitare bolle di gas pressurizzato da costruire.
3. Luogo NGM liquido in bagno d'acqua a 55 ° C o in panchina a raffreddare.
4. Una volta NGM raggiunge i 55 ° C, aggiungere 33 ml di FUDR 150 mm e 100 ml di 100 mg / ml per 100 ml Ampicillina NGM (per Amp / FUDR piatti) e mescolare. Per piastre NGM senza farmaci aggiuntivi passare direttamente al punto 1.5.
5. Usando la tecnica sterile, pipetta 10 mL NGM in ogni piatto 60 millimetri di Petri. Evitare la formazione di bolle, se possibile. Se le bolle si formano, possono essere spuntato con un puntale.
6. Lasciare le piastre sul banco con coperchi a permettere NGM solidificare e asciugare. Se possibile, lasciare le piastre sul banco per 2 giorni prima di aggiungere i batteri, ma 1 giorno funzionerà se le targhe sono necessarie prima.
7. Il giorno prima le piastre finitura essiccazione, liquido cultura seme LB con una singola colonia da una vena fresca di E. coli OP50 batteri su agar LB. Si dovrebbe preparare almeno 1 ml di una notte OP50 cultura a 60 mm.
8. Luogo OP50 cultura in 37 ° C shaker e permettere ai batteri di crescere durante la notte (la cultura dovrebbe raggiungere la saturazione).
9. Pellet OP50 batteri facendo girare a 3.500 g per 10 minuti.
10. Rimuovere il 90% dei batteri surnatante e risospendere di concentrarsi cultura 10x.
11. Pipettare 100 l di 10x concentrata OP50 cultura al centro delle piastre NGM solidificato. Agitare delicatamente piatti di diffondere la cultura dei batteri, se necessario (idealmente batteri dovrebbero coprire l'area centrale della NGM senza entrare vicino alle mura della piastra). Cercate di evitare di toccare la punta della pipetta sulla superficie della NGM, come difetti nella superficie del supporto permettono i vermi a scavare nel NGM.
12. Lasciare le piastre sul banco durante la notte per permettere ai batteri di cultura asciugare sul NGM solido (in genere dura circa 24 ore).
13. Una volta asciutto, esporre la superficie delle piastre ad una dose UV sufficiente ad arrestare la crescita dei batteri. Se si utilizza un Stratalinker UV Stratagene 2400:
    • Piastre posto nella Stratalinker e togliere coperchi
    • Chiudere la porta e accendere la Stratalinker
    • 'Energia' stampa
    • Inserisci '9999 'usando la tastiera
    • 'Start' stampa
    • Le piastre saranno esposti a raggi UV per circa 5 minuti
14. Piastre con batteri uccisi UV possono essere conservati a testa in giù a 4 ° C per un massimo di 1 mese.

Parte 2: Eseguire un uovo di tempo che per acquisire un età sincronizzato popolazione di animali

In questa sezione abbiamo generare una popolazione di vermi con un comune tratteggiati data. Questo si ottiene agli adulti sessualmente attivi di deporre le uova su un piatto per un periodo definito di tempo e consentendo a tali uova di svilupparsi.

1. (Opzionale) Trasferimento di circa 20 vermi adulti giovani per un piatto fresco senza FUDR NGM. Lasciare le piastre a 25 ° C al fine di consentire worm di propagarsi attraverso e mangiare tutto il cibo batterica. Dopo che il cibo dei batteri è stato consumato vermi appena schiusi entrerà nella fase di crescita arrestato dauer. Si inizierà a vedere la larva dauer circa entro una settimana, a seconda di quanti vermi si trasferisce alla piastra inizialmente. Dauer larva può essere utilizzato per i passi successivi per un massimo di 1 mese.
2. (Opzionale) Trasferimento 20-30 larva dauer ad una piastra NGM fresca senza FUDR. In presenza di larve cibo dauer diventeranno adulti sessualmente attivi entro 2 giorni e rimangono sessualmente attivi per alcuni giorni in seguito a 25 ° C.
3. Trasferimento 10-15 adulti sessualmente attivi ad una piastra NGM fresca senza FUDR. Questo piatto è denominato deposizione delle uova a tempo (TEL) piastra.
4. Lascia la piastra TEL a 25 ° C per 6 ore al fine di consentire tha tempo worm per deporre le uova.
5. Togliere i vermi adulti dal piatto TEL. Piastra può essere ispezionato visivamente per le uova prima di rimuovere gli adulti. Se il worm non hanno gettato un numero sufficiente di uova della piastra TEL può essere lasciato a 25 ° C fino a un totale di 24 ore prima di rimuovere i vermi adulti.
6. Luogo TEL piastra a 20 ° C fino a quando le uova si sono schiuse e il worm si sono sviluppati allo stadio larvale L4 (solitamente ciò richiede 2 giorni per tipo selvaggio C. elegans, ma può richiedere più tempo per i ceppi con fenotipo lento sviluppo).

Parte 3: gli animali Punteggio per la durata della vita

In questa sezione seguiamo l'età sincronizzato popolazione di vermi da parte 2 fino alla morte. I worm sono mantenuti in Amp / FUDR piastre per prevenire la produzione di uova e di contaminazioni batteriche e sono considerati morti se non riescono a rispondere agli stimoli esterni.

1. Trasferimento L4 larva a seminato Amp / FUDR piatti. Per ogni ceppo o condizione in fase di sperimentazione, è tipico di impostare 2-3 piatti con 25-30 vermi per piastra. Immagini della C. fasi della vita elegans sono forniti per riferimento (Figura 1) ^1.
2. Luogo Amp / FUDR piastre a 20 ° C per 24 ore.
3. Dopo 24 ore, visivamente valutare i vermi, i media, e batteri. Trasferimento a fresco worm Amp / FUDR piastre se uno qualsiasi dei seguenti requisiti:
   • I vermi hanno mangiato la maggior parte del cibo batterica. All'inizio i vermi durata della vita esperimento dovrà essere trasferiti 1 a 2 volte la settimana per evitare che i batteri di essere impoverito.
   • Un numero significativo di larve sono presenti. Questo di solito è un'indicazione che i vermi sono stati trasferiti al Amp / FUDR piatti come i giovani adulti, invece di L4s e sono stati in grado di porre alcune uova FUDR prima della entrata in vigore. Il FUDR generalmente impedisce alle larve di crescere in adulti a tariffa intera, ma a volte alcuni si svilupperà in adulti e si confondono con gli animali sperimentali.
   • Batteri vivi / crescita sono osservate. In generale, la combinazione di Amp e UV-uccisione farà in modo che i batteri non vivono contaminare l'esperimento, ma di tanto in tanto si verifica.
   • Crescita fungina si osserva sui media. Se diagnosticato precocemente, la crescita fungina di solito può essere tagliato con l'ausilio di un puntale o spatola. Una volta che cresce fino a essere più grande di pochi millimetri di diametro, di solito è più facile trasferire i vermi a un piatto nuovo.
   • Utilizzando la portata dissezione, determinare se ogni worm è vivo o morto.
   • Battere delicatamente la piastra. Il worm è vivo se si muove in risposta alle intercettazioni.
   • Se il worm non risponde al toccando l', zoom piastra sulla regione della testa.
   • Battere delicatamente la testa del verme con pick platino trasferimento. Punteggio ottenuto il worm come morto se non risponde muovendo la testa.
   • Vermi morti possono essere rimossi dalla piastra.
4. Registrare la data e il numero di worm che sono vivi e morti.
5. Ritorna piastre a 20 ° C.
6. Ripetere i passi da 3.3 fino a 3,6 ogni 2 o 3 giorni fino a quando tutti i vermi sono morti.

Parte 4: Risultati Rappresentante.

I dati grezzi prodotti da un esperimento durata nematode la vita è un elenco di date con i numeri corrispondenti di vermi che sono vivi e morti per ogni ceppo testato. Il numero di worm che muoiono ogni giorno è tipicamente invertita per calcolare la percentuale di vermi vivi ogni giorno (Figura 2A), che è tracciata graficamente come una curva di sopravvivenza (Figura 2B, il giorno della deposizione delle uova tempo è considerato giorno 0 ). La durata per ogni singolo verme nello studio possono essere calcolati dal conteggio di vermi che muoiono ogni giorno e utilizzato per calcolare la durata della vita media e mediana per il confronto tra i ceppi. Il conteggio del numero di vermi vivi ogni giorno non viene utilizzato direttamente nell'analisi durata della vita. Worms mantenuta su terreni solidi a volte 'fuga', o strisciare verso l'alto la parete della piastra o giù di sotto della media. Il numero di vermi vivi ogni giorno può essere usato per determinare il numero di worm sono fuggiti in tutto il corso dell'esperimento. Worm che fuggono sono tipicamente rimosso dall'analisi. Come punto di riferimento, la durata della vita media tipica di N2, il C. elegans ceppo selvatico, mantenuti in UV-ucciso i batteri a 20 ° C è di circa 25 giorni, come misurato da un uovo.

Parte 5: Soluzioni

Nematode crescita Media (NGM), 100 ml:
Combina:
0,3 g	NaCl
0,25 g	Peptone
2 g	Agar
Autoclave per 40 minuti e lasciare raffreddare a 55 ° C, quindi aggiungere:
100 ul	1 M MgSO 4
100 ul	5 mg / ml colesterolo
100 ul	1 M CaCl2
1,625 ml	1,5 M pH 6,0 Kpi
NGM liquido può essere utilizzato immediatamente a versare piatti o lascia solidificare e conservati a lungo termine a temperatura ambiente

Luria Broth (LB), 1L:
10 g	BactoTryptone
5 g	Estratto di Lievito
10 g	NaCl
10 mL	1 M Tris pH 8.0
1 L	acqua deionizzata
Autoclave e conservare a temperatura ambiente.

1 M MgSO 4, 300 ml:
73,95 g	MgSO 4
300 mL	acqua deionizzata
Autoclave e conservare a temperatura ambiente.

5 mg / ml colesterolo, 200 ml:
1 g	colesterolo
200 mL	100% di etanolo
Filtro sterilizzare e conservare a temperatura ambiente.

1 M CaCl 2, 500 ml:
27,75 g	CaCl 2
500 ml	acqua deionizzata
Filtro sterilizzare e conservare a temperatura ambiente.

KPI 1,5 M pH 6.0, 1L:
Combina:
31,4 g	Kpi bibasico
179,6 g	Kpi monobasico
850 ml	acqua deionizzata
Calore durante la miscelazione per consentire KPI a dissolversi in soluzione. Regolare il pH a 6,0 con NaOH 10 N.
Aggiungere acqua deionizzata a 1 L.
Autoclave e conservare a temperatura ambiente.

1 M Tris, pH 8.0:
60,57 g	Tris
400 mL	acqua deionizzata
Regolare il pH a 8,0 con HCl.
Aggiungere acqua deionizzata a 500 ml.
Filtro sterilizzare e conservare a temperatura ambiente.

150 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR), 10 ml:
0,3693 g	FUDR
10 mL	sterile di acqua deionizzata
Conservare a -20 ° C.

100 mg / ml Ampicillina (Amp), 10 ml:
1 g	Ampicillina
10 mL	sterile di acqua deionizzata
Conservare a -20 ° C.

50 mg / ml Carbenicillin (CARB), 10 ml:
500 mg	Carbenicillina
10 mL	sterile di acqua deionizzata
Conservare a -20 ° C.

1 M Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG), 10 ml:
2,38 g	IPTG
10 mL	sterile di acqua deionizzata
Conservare a -20 ° C.

Immagini campo Figura 1. Brillante di C. fasi della vita elegans, tra cui uova, i quattro stadi larvali (L1 - L4) e adulti. Tutti i pannelli mostrano ermafroditi tranne in basso a destra, che mostra un maschio adulto (immagine da Wood (1988)).

I risultati rappresentativi Figura 2. Dal C. sperimentare la vita elegans durata confrontando ceppo selvatico N2 tipo di un ceppo che contiene una mutazione nel gene daf-2. (A) una tabella che mostra i dati raccolti, incluso il numero di giorni dal worm sono state le uova, il numero di vermi morti osservati ogni giorno, e la percentuale del campione originale rimanendo in vita ogni giorno (come calcolato dai conti ogni giorno di vermi morti) . (B) Sopravvivenza curve corrispondenti ai dati di durata della vita previsto (A).

Figura 3. Rappresentante di lipofuscina confronto tra adulti C. giovani e anziani elegans. Immagini in campo chiaro vengono visualizzati sul sinistro e canale di fluorescenza DAPI immagini sulla destra. I pannelli in alto mostrano un worm 4 giorni vecchi e pannelli inferiori mostrano un verme 11 giorni di età (come misurato da uova).

Discussione

Il controllo genetico della longevità è stato studiato estensivamente in C. elegans, in gran parte dovuto alla facilità e rapidità con cui durata può essere determinata. Il protocollo descritto in questo articolo descrive un quadro di base per ottenere dati riproducibili durata della vita in C. elegans e può essere applicato anche alle specie relatednematode ^2. Facendo alcune modifiche semplici queste procedure possono essere adattati per misurare la durata della vita sotto una varietà di co...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agar	Reagente	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Ampicillina	Reagente	MidSci	0339
BactoTriptone	Reagente	Fisher Scientific	DF0123-17-3 (211705)
BactoPeptone	Reagente	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
CaCl2	Reagente	Fisher Scientific	NC9699248 (1332-01)
Carbenicillina	Reagente	Biotecnologia dell'Oro	C0109
Colesterolo	Reagente	Sigma-Aldrich	C75209
Fluorosossiuridina (FUDR)	Reagente	Sigma-Aldrich	F0503
Isopropilo β-d-Tiogalattitociranoside (IPTG)	Reagente	Biotecnologia dell'Oro	I2481C5
KPi Dibasic	Reagente	Fisher Scientific	5087862 (3252-01)
KPi Monobasic	Reagente	Fisher Scientific	5087861 (3246-01)
MgSO4	Reagente	Fisher Scientific	NC9561800 (2500-01)
NaCl	Reagente	Fisher Scientific	S251
Tris	Reagente	Sigma-Aldrich	T1503
Estratto di lievito	Reagente	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)