Articolo metodologico
GFP-fusion proteine sono ampiamente utilizzati per visualizzare organelli mediante microscopia confocale. Tuttavia, lo screening per le mutazioni che influenzano la morfologia degli organelli generalmente richiede mutagenesi individuale e richiede molto tempo. Qui, dimostriamo un metodo per integrare simultaneamente organello-GFP marcatori in quasi 5.000 non essenziali geni nel lievito.
High-throughput metodi per esaminare la localizzazione di proteine o morfologia organello è uno strumento efficace per studiare le interazioni delle proteine e può aiutare a raggiungere una comprensione completa delle vie molecolari. In Saccharomyces cerevisiae, con lo sviluppo del non essenziali serie gene cancellazione, siamo in grado di studiare a livello globale la morfologia degli organelli diversi, come il reticolo endoplasmatico (ER) e la GFP mitocondri utilizzando (o variante)-marcatori in geni diversi contesti. Tuttavia, i marcatori GFP incorporando in ogni singolo mutante è individualmente un lavoro processo ad alta intensità. Qui, descriviamo una procedura che viene normalmente utilizzato nel nostro laboratorio. Utilizzando un sistema robotico per gestire array ad alta densità di lievito e le tecniche di selezione dei farmaci, siamo in grado di ridurre significativamente il tempo richiesto e migliorare la riproducibilità. In sintesi, attraversiamo un GFP-tagged marcatore mitocondriale (Apc1-GFP) ad un alta densità serie di 4.672 mutanti delezione del gene non essenziale dalla robotica replica pinning. Attraverso la selezione diploide, sporulazione, germinazione e la selezione marcatore duale, abbiamo recuperare entrambi gli alleli. Come risultato, ogni mutante aploide singolo contiene Apc1-GFP incorporato al suo locus genomico. Ora, possiamo studiare la morfologia dei mitocondri in tutti i non essenziali sfondo mutante. Utilizzando questo approccio high-throughput, possiamo comodamente studiare e delineare i percorsi e geni coinvolti nella eredità e la formazione di organelli in un genoma impostazione.
Materiali e metodi:
SGA media:
I media di crescita (YPD) e dei media la selezione (SD) utilizzato in questo protocollo è utilizzato di routine nella biologia molecolare del lievito. Si prega di fare riferimento al metodo di lievito (Amberg et al., 2005) per le descrizioni dettagliate.
LRK, LHRK media (per 400 ml totali)
| Aggiungi al fine | Quantità |
| Lievito base azotata con solfato di ammonio | 2,7 g |
| Aminoacidomescolare | 0,8 g |
| Agar | 8 g |
| dH 2 O | 360 ml |
| Autoclave | |
| 20% di destrosio | 40 ml |
| Raffreddare a 65 ˚ C | |
| 100 mg / ml canavanina | 0,2 ml |
| 100 mg / ml thialysine | 0,2 ml |
| Mescolare, versare 50 ml per piastra | |
LRK, LHRK + G418 media (per 400 ml totali)
| Aggiungi al fine | Quantità |
| Lievito base azotata senza solfato di ammonio | 0,7 g |
| Acido mix di aminoacidi | 0,8 g |
| Glutammato monosodico | 0,4 |
| Agar | 8 g |
| dH 2 O | 360 ml |
| Autoclave | |
| 20% di destrosio | 40 ml |
| Raffreddare a 65 ˚ C | |
| 100 mg / ml canavanina | 0,2 ml |
| 100 mg / ml thialysine | 0,2 ml |
| 200 mg / ml di G418 | 0,4 ml |
| Mescolare, versare 50 ml per piastra | |
Arricchito sporulazione media (per 400 ml totali)
| Aggiungi al fine | Quantità |
| Acetato di potassio | 4 g |
| Estratto di lievito | 0,4 g |
| Destrosio | 0,2 g |
| Sporulazione mix di aminoacidi | 0,04 g |
| Agar | 8 g |
| dH 2 O | 360 ml |
| Autoclave | |
| Raffreddare a 65 ˚ C | |
| 200 mg / ml di G418 | 0,4 ml |
| Mescolare, versare 50 ml per piastra | |
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Questo metodo può aiutare in modo efficiente incorporare un marcatore mitocondriale, Acp1-GFP in vari contesti mutante. Essa si basa sull'utilizzo di un sistema robotico, e può essere facilmente adottata per l'utilizzo con qualsiasi sistema robotico. Questa procedura può essere utilizzata anche per l'integrazione di altri tipi di marcatori. Ad esempio, per visualizzare ER, si usano abitualmente il marcatore Erg11-GFP. Nelle nostre immagini rappresentative, un mutante e un tipo selvaggio con la Acp1 GFP-creat...
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Questo lavoro è stato sostenuto dal Biotechnology and Biological Sciences Research Council (sovvenzione 31/C15982), il Canadian Institutes of Health Research, la Fondazione canadese per l'innovazione, la British Columbia Fondo di conoscenza per lo sviluppo, la Michael Smith Fondazione per la Ricerca sulla Salute (sovvenzione per CJR Loewen), e lotta per la vista.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Mezzi SGA | I mezzi di crescita (YPD) e i mezzi sintetici di dropout (SD), inclusi LRK e LHRK, e il mezzo arricchito per la sporulazione utilizzati in questo protocollo sono comunemente impiegati nella biologia molecolare del lievito. Per descrizioni dettagliate, consultare Methods in Yeast (Amberg et al., 2005). |
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