Topo surrenale cromaffini cella di isolamento

Sommario

Midollare surrenale cromaffini sistemi di colture cellulari sono estremamente utili per lo studio della secrezione di accoppiamento eccitazione-in un ambiente in vitro. Questo protocollo illustra il metodo utilizzato per analizzare le ghiandole surrenali e quindi isolare la regione midollare strappando via la corteccia surrenale. La digestione del midollo in singole cellule cromaffini è poi dimostrato.

Abstract

Midollare surrenale cromaffini sistemi di colture cellulari sono estremamente utili per lo studio della secrezione di accoppiamento eccitazione-in un ambiente in vitro. Questo protocollo illustra il metodo utilizzato per analizzare le ghiandole surrenali e quindi isolare la regione midollare strappando via la corteccia surrenale. La digestione del midollo in singole cellule cromaffini è poi dimostrato.

Protocollo

Abbreviazioni:
ACC - surrenale cellule cromaffini, E. Soln - soluzione enzimatica, E. DMEM - Arricchito Dulbecco modificato Aquila Media

1. Preparazione
   1. Aggiungi alla papaina quantità desiderata di E. Soln (40 unità papaina / 1ml E. Soln.).
   2. Attivare la papaina con CarboGen per circa 15 minuti in ghiaccio. Buffer di ossigenare di Locke sul ghiaccio pure.
      
2. Dissezione
   1. Utilizzare il mouse 8-10 settimana.
   2. Prima di rimuovere la digestione ossigenato tampone di Locke e posto sul ghiaccio.
   3. Fare riferimento al video per la procedura di dissezione.
   4. Una volta asportato, ghiandole posto in ossigenato buffer di Locke.
      
3. Preparazione di Gland
   1. Rimuovere il grasso dalla ghiandola.
   2. Striscia di corteccia dalla ghiandola.
      
4. Digestione enzimatica
   1. Filtro sterile ossigenato papaina.
   2. Fare quattro piscine di papaina ossigenata su una piastra di Petri.
      1. 3 piscine dovrebbe essere di circa 100uls.
      2. 1 del pool dovrebbe essere di circa 400uls.
   3. Lavare medullae attraverso piscine
      1. 1 al 3 piscine 100ul.
      2. Poi attraverso il pool 400ul
      3. Pippette 300ul E. Soln e midollo pezzi da piscina 400ul in provetta per microcentrifuga.
      4. Qrap parafilm in provetta da microcentrifuga e porre in bagno d'acqua a 37 ° C per 20 min.
      5. Ricordatevi di continuare a ossigenare restanti E. Soln contenenti papaina.
      6. Dopo 20 minuti filtro sterile più E. Soln.
      7. Sostituire il vecchio E. medullae balneari Soln con nuova filtrata E. Soln.
         
5. Triturazioni
   1. Aspirare e scartare E. Soln.
   2. Lavare medullae in 1 ml E. DMEM.
   3. Aspirare e scartare E. DMEM.
   4. Aggiungi 300ul E. DMEM e triturare 20X con 1 ml di punta.
   5. Taglio punta 200ul con lama di rasoio sterile.
   6. Triturare 5-10X con punta tagliata 200ul.
   7. Scartare E. DMEM pezzi medullae bagno. Media conterrà detriti.
   8. Aggiungi 300uls fresca E. DMEM medullae a pezzi.
   9. Triturare con punta 200ul 20x
   10. Pippette E. DMEM per microcentrifuga tubo withough pezzi medullae. Media conterrà ACC libero.
   11. Aggiungi 300uls fresca E. DMEM medullae a pezzi.
   12. Triturare medullae con un ago da siringa 23,5 calibro 20x.
   13. Combina E. DMEM da entrambe le triturazioni. Pezzi Medullae non dovrebbe essere presente e ora dovrebbe avere un aspetto piume.
       
6. Placcatura
   1. Microcentrifuga E. DMEM dagli ultimi due passi triturazione per 2,5 minuti a 3.7g s.
   2. Risospendere le sfere in 50uls-200 E. DMEM, a seconda esperimenti successivi.
   3. Piastra 10-30uls su un vetrino di vetro.
   4. Attendere 15 minuti per le cellule di aderire.
   5. Aggiungi 750uls di E. DMEM.