Ubiquitinazione è una modificazione post-traslazionale chiave svolto da una serie di tre enzimi. Le mutazioni di geni coinvolti in questa modifica sono associati a diverse malattie umane. Qui, descriviamo i protocolli per rilevare ubiquitinazione delle proteine in cellule in coltura In vivo E provette In vitro.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Rilevamento di proteine Ubiquitinazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ubiquitinazione, l'attacco covalente del ubiquitina polipeptide a bersaglio le proteine, è una modificazione post-traslazionale chiave svolto da una serie di tre enzimi. Essi comprendono l'attivazione di enzimi ubiquitina-E1, ubiquitina-coniugando enzima E2 ed E3 ubiquitina ligasi. A differenza di E1 ed E2, E3 ubiquitina ligasi visualizzare specificità di substrato. D'altra parte, numerosi enzimi deubiquitylating hanno un ruolo nella trasformazione delle proteine polyubiquitinated. Ubiquitinazione può risultare in cambio di stabilità proteica, localizzazione cellulare, e l'attività biologica. Le mutazioni di geni coinvolti nella ubiquitinazione / deubiquitination percorso o alterata funzione del sistema ubiquitina sono associati a molte malattie umane come vari tipi di cancro, neurodegenerazione e disordini metabolici. Il rilevamento di ubiquitinazione alterata o normale di proteine bersaglio può fornire una migliore comprensione della patogenesi di queste malattie. Qui, descriviamo i protocolli per rilevare ubiquitinazione delle proteine in cellule in coltura
Protocollo
Rilevazione di ubiquitinazione delle proteine in cellule in coltura
- Trasfettare cellule in coltura con i plasmidi che esprimono la proteina di interesse e (epitopo-tagged versione) ubiquitina.
- Di dare integrale buffer di lisi cellulare (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) con orthovanadate sodio 2mM, 50 mM fluoruro di sodio, e gli inibitori della proteasi.
- Lisare le cellule con 100 microlitri di buffer lisi cellulare per piastra (6 piatto cm). Se una parabola più grande viene utilizzato, regolare il volume di conseguenza. Agitare il piatto con attenzione per lasciare che il tampone di lisi coprire l'intera area di cellule....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
In questa presentazione, abbiamo prima descritto passi che permettono di rilevare la modifica ubiquitina su una proteina di interesse in colture di cellule di mammifero. Al fine di rilevare l'ubiquitinazione in particolare sulla proteina di interesse, non su non covalente delle proteine che interagiscono, abbiamo usato una condizione rigorosi per la lisi cellulare, immunoprecipitazione e lavaggio 1,3. Ubiquitinazione, rilevato da immunoprecipitazione della proteina bersaglio in una condizione dura segui.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH RO1 DC006497, RO1 NS057289 e PO1 ES016738 (alla Z. Zhang), California Institute per la Medicina Rigenerativa concede RS1-00331-1 e RL1-00682-1 (alla Z. Zhang), il Parkinson americano Disease Association (alla Z. Zhang e YS Choo) e la Michael J. Fox Foundation for Parkinson Research (Z. Zhang).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Riferimenti
- Xiong, H. PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation. J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).
- Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibit....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
