Selezione, microiniezione, e l'imaging di fluorescenza marcata con F-actina tramite microscopia a fluorescenza speckle (FSM).
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Articolo metodologico
Imaging cellulare dal vivo di F-actina Dynamics tramite microscopia a fluorescenza Speckle (FSM)
In questo articolo
Sommario
Abstract
In questo protocollo si descrivono l'uso della microscopia a fluorescenza Speckle (FSM) di catturare immagini ad alta risoluzione delle dinamiche di actina in cellule PtK1. Un vantaggio unico del FSM è la sua capacità di catturare il movimento e la cinetica fatturato (montaggio / smontaggio) della F-actina rete all'interno delle cellule viventi. Questa tecnica è particolarmente utile nel derivare misurazioni quantitative di F-actina dinamiche se abbinato con il software di visione artificiale (qFSM). Descriviamo la, microiniezione selezione e la visualizzazione di sonde fluorescenti actina in cellule viventi. È importante sottolineare che le procedure siano applicabili alla visualizzazione assemblee macomolecular altri. FSM è stata dimostrata per microtubuli, filamenti intermedi, e complessi di adesione.
Protocollo
Sezione 1: Ottenere il vostro actina fluorescente per FSM
Materiali richiesti: purificato actina, fluoroforo (Alexa, X-rodamina consigliato). G-buffer, ultracentrifuga
- Un componente chiave per l'acquisizione di filmati FSM buona impone l'etichettatura corretta di actina (o altre proteine del citoscheletro) con il fluoroforo di vostra scelta.
Si consiglia di utilizzare fluorofori di Alexa (488, 568 lunghezze d'onda) e X-rodamina derivati esteri succinimidile che l'obiettivo esposto residui di lisina sulla superficie di actina. - Quando scegli il tuo fluoroforo e la sua lunghezza d'onda appr....
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Discussione
Diversi sono i fattori chiave fondamentale per riuscire a ottenere immagini speckle, per quanto buone macchioline iniziano e terminano con la qualità della vostra actina fluorescente. Un rapporto di etichettatura elevati di colorante di actina monomero, disposti intorno a 0,4-0,7 farà in modo che puntini apparirà luminoso e discreto, mentre la proteina etichettata stesso dovrebbe essere solubile e priva di aggregati. Altrettanto importante è la procedura di microiniezione. Per assicurare la normale omeostasi cellulare (.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Ringraziamenti
Lo sviluppo di qFSM è finanziato dalla sovvenzione NIH U01 GM06230.
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Materiali
Iniezione del buffer (IB)
50 mM glutammato di potassio
0,5 M MgCl2 (ALLEGATO 2A)
Memorizzare fino a 2 anni a -20 ° C
G-buffer
2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8,0 (ALLEGATO 2A)
0,2 mM CaCl2 (ALLEGATO 2A)
Aggiungi al momento dell'uso:
0,2 mm ATP (vedi ricetta per 100 mm)
0,5 mM di 2-mercaptoetanolo
Riferimenti
- Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin network....
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Ristampe e permessi
