Gli autori non hanno nulla da rivelare.

fattore-coated crescita placement bead su espianti forebrain dorsali

Questo video mostra due metodi per la preparazione e l&#39;immissione perline, che sono stati rivestiti con fattore di crescita, su espianti sviluppo della corteccia cerebrale. Queste sfere possono essere utilizzate per indurre l&#39;espressione genica spazialmente limitata nello sviluppo del tessuto neurale come espianti proencefalo. I metodi sono indicati per l&#39;utilizzo di entrambi i Affi-Gel perline e perle di eparina acrilico.

Fattore-Coated crescita Placement Bead su Espianti Forebrain dorsali

Quindi questi sono i primi tipi di perline che userò. Sono le perle di gel blu. Sono morbidi.Quindi ho bisogno di usare una pipetta di vetro a raccolta all'estremità di una pipetta per bocca per posizionare queste perline su Xs.Il secondo tipo di perlina che dimostrerò sono le perle acriliche di eparina. Sono un tipo di perlina rigida e posizionerò queste perline su espianti X usando un ago di tungsteno. Quindi questi sono i tubi capillari di vetro che fonderò per la prima volta usando il bruciatore bunsen.Poi li tiro per creare una punta più fine. Quindi tengo il tubo capillare al centro della fiamma e lo faccio rotolare mentre il tubo si scioglie. Riesco a sentirlo diventare morbido.Lo solleverò dalla fiamma e poi lo tirerò fuori. Ho intenzione di incidere una linea attraverso il tubo capillare con questa penna con punta di diamante in modo da poter avere un bel taglio dritto. Quindi lucido alla fiamma le estremità per pulirle.Passerò il capillare attraverso la fiamma per lucidare l'estremità e rendere l'apertura più piccola in modo che possa catturare una perlina piuttosto che la perlina che passa attraverso il capillare. Una cosa importante da notare è che non si vuole tenere il tubo capillare nella fiamma molto a lungo. In realtà è un passaggio molto veloce, altrimenti sigillerà.Di solito ne faccio diversi perché molti di essi risultano dove la punta è sigillata dalla fiamma. È difficile da controllare, quindi ne fai solo diversi. Questo è un esempio di uno in cui la punta è stata sigillata.Questo è un esempio di una buona pipetta. Ho pipettato 250 microlitri di perle di agel in questo tubo di einor e le laverò cinque volte con un millilitro di PBS per rimuovere la soluzione azi in cui erano immerse. Aspetterò circa tre minuti per lasciare che le perline si depositino e poi aspirerò il PBS in eccesso e ripeterò l'operazione altre quattro volte.Le perline non si sono ancora del tutto stabilizzate, quindi le perline si sono depositate e aspirerò il PBS in eccesso e ripeterò l'operazione quattro volte. E alla fine aggiungerò 300 microlitri di PBS e inizierò a lavorare con le perline. Questa è una pipetta per bocca standard e prenderò solo il capillare che ho tirato e lo spingerò lì a circa un terzo della strada.Per prima cosa, riempire le pipette con PBS. Di solito si riempie solo con un'azione capillare. Quindi questo è un coperchio di un piatto di coltura da 30 millimetri e ho messo una goccia di perline in blu.E accanto ad esso c'è una piccola gocciolina di PBS. E in questo piatto c'è una goccia di cinque microlitri di soluzione proteica. In questo caso, si tratta di B e P quattro, ma è possibile utilizzare una proteina a scelta utilizzando la pipetta orale.Trasferirò una perlina da questo cerchio blu qui, sciacquela una volta nella gocciolina di PBS. Quindi prenderò la perlina con la pipetta orale e la metterò nella gocciolina di soluzione proteica e la incuberò a temperatura ambiente per circa un'ora o quattro gradi per diverse ore. Quindi lì vedi un pool di perline in PBS e devo selezionare perline della giusta dimensione.Se sono troppo piccoli, passeranno semplicemente attraverso la pipetta orale. Hanno bisogno di sedersi alla fine. Quindi ora vedete che ho scelto alcune perline, tre perline più grandi e tre perline più piccole.Userò le perline più grandi nell'esperimento. Ora trasferirò una grossa perlina dalla gocciolina di PBS alla gocciolina di soluzione proteica. E per farlo, tirerò delicatamente indietro la lingua dalla pipetta orale.Non è un movimento di suzione, ma solo per applicare una certa pressione negativa. E poi lo trasferirò e poi fondamentalmente rimetterò la lingua sulla bocca. La testa del tubo, non soffia, ma aggiunge solo una certa pressione positiva per spingere il battito fuori dalla fine.Ora ho cinque perle nella gocciolina della soluzione proteica e le incuberò a quattro gradi per diverse ore, o in alternativa a temperatura ambiente per mezz'ora o un'ora. Quindi questo è il piatto di coltura che contiene la membrana che galleggia nei terreni insieme alle melanzane che ho già sezionato. Prenderò la punta della mia pipetta e aspirerò un po' di terreno.Ho intenzione di sciacquare le perline in una goccia di supporto solo una volta immediatamente prima di posizionare la perlina sulla spiegazione X. Questi sono gli aghi di tungsteno che userò per raccogliere e posizionare le perline acriliche. Questo è l'ago di tungsteno ed è ora nel suo supporto.E queste sono delle belle pinze. Con un angolo di 45 gradi. Userò il mio ago di tungsteno in una pinza per sollevare una perlina da questa pozza di PBS e trasferire la perlina su una goccia di soluzione proteica.Come ho fatto con le perline di agel. Come per le perline agel, ho risciacquato queste perline acriliche cinque volte in PBS e ho trasferito una goccia su questa piastra. Userò quindi il mio ago di tungsteno in una pinza per trasferire una perlina in una gocciolina di proteina e incubare proprio come ho fatto con le perle di gel.Quindi è un sollevare il tallone. Ho la mano destra saldamente appoggiata al tavolo e uso l'indice sinistro per tenere fermo l'ago mentre scendo nel fluido, tocco leggermente una perlina con un ago e la sollevo lentamente dal fluido. A volte cade dall'ago, quindi torna indietro per un altro.Ora con la mia mano sinistra, ho il forcipe con angolo di 45 gradi. Con le punte rivolte verso il basso, tocco la perlina e l'ago con il fluido e uso. Usa la punta della pinza per spingerla via delicatamente.Quindi ora ho cinque perle di proteine. Ok, quindi con la mia mano destra ho l'ago di tungsteno nel tallone, e la mia mano sinistra, le mie pinze di nuovo con la punta verso il basso nello stesso modo in cui le spingo via I quattro, lo farò di nuovo qui sulla spiegazione x. Incubare a 37 gradi e il tempo dipende dal particolare test.

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Research

JoVE Journal

Biology

Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

University of California, Irvine (UCI).  Questo video mostra due metodi per la preparazione e l'immissione perline, che sono stati rivestiti con fattore di crescita, su espianti sviluppo della corteccia cerebrale. Queste sfere possono essere utilizzate per indurre l'espressione genica spazialmente limitata nello sviluppo del tessuto neurale come espianti proencefalo. I metodi sono indicati per l'utilizzo di entrambi i Affi-Gel perline e perle di eparina acrilico.

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