È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Raccolta e Preparazione Drosophila Gli embrioni per la registrazione elettrofisiologici e altre procedure

12.9K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/1347

⸱

20 maggio 2009

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Illinois, 2Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

In questo articolo

Sommario

Questa tecnica espone il neuromusculature Drosophila embrionali per immunoistochimica o registrazione elettrofisiologica. E 'utile per studiare eventi precoci nello sviluppo neuromuscolare o l'esecuzione di elettrofisiologia in mutanti che non possono schiudersi.

Abstract

Drosophila è un modello premier genetico per lo studio sia dello sviluppo embrionale e funzionale delle neuroscienze. Tradizionalmente, questi campi sono abbastanza isolati gli uni dagli altri, con storie in gran parte indipendenti e le comunità scientifiche. Tuttavia, l'interfaccia tra questi campi di solito disparati sono i programmi di sviluppo funzionali alla base dell'acquisizione di proprietà elettriche di segnalazione e la differenziazione delle sinapsi chimici funzionali durante le fasi finali della formazione circuito neurale. Questa interfaccia è un'area estremamente importante per le indagini. In Drosophila, queste fasi di sviluppo funzionale si verificano durante un periodo di <8 ore (a 25 ° C) durante l'ultimo terzo di embriogenesi. Questo periodo tardo di sviluppo è stato a lungo considerato intrattabile a causa indagine per la deposizione di un duro, cuticola impermeabile epidermica. Un passo avanti è stato anticipato l'applicazione di acqua-polimerizzazione colla chirurgica che può essere applicata a livello locale per la cuticola per permettere la dissezione controllato di fase avanzata di embrioni. Con una incisione longitudinale dorsale, l'embrione può essere posato piatto, esponendo il cordone ventrale dei nervi e muscolatura della parete del corpo di indagine sperimentale. Questo sistema è stato molto utilizzato per isolare e caratterizzare mutanti genetici che impedire la formazione embrionale sinapsi, e quindi svelare i meccanismi molecolari che regolano la specificazione e differenziazione delle connessioni di sinapsi e funzionali, le proprietà di segnalazione sinaptica.

Protocollo

Parte 1: Attrezzature e Forniture

  1. Un microscopio a dissezione buona è necessaria per dissezioni embrione; ingrandimento 40X è suggerito, con 25X oculari per aumentare al massimo ingrandimento.
  2. Una pinza sottile (numero 5) sono necessari per la selezione manuale di embrioni e devitellinization degli embrioni.
  3. Attrezzature per creare e modificare gli aghi buon bicchiere è richiesto. Tirato in vetro aghi sono necessari per la dissezione. Noi preferiamo vetro solido per la dissezione (durano più a lungo), ma di serie pareti spesse tubo di vetro (diametro esterno 1-1,5 mm) funziona pure. Alcune persone usano aghi tungsteno fine, elettrolizzata per la nitidezza desiderata in un bagno di NaOH 1M con un + 10 Amp batteria autotrasformatore. Aghi affilati dissezione tungsteno hanno il vantaggio di essere relativamente resistenti e di lunga durata. Aghi di vetro cavo (formato simile a elettrodi di patch clamp) sono collegati a tubi di plastica e utilizzato durante la dissezione per l'aspirazione ed espulsione di soluzione salina, così come la consegna controllata di colla. Una varietà di estrattori di vetro sono disponibili per la produzione di aghi di vetro. Computer programmato estrattori può essere regolato per tirare una varietà di forme e dimensioni. Il Brown-Flaming modelli (Sutter Instrument Co.) sono ampiamente favorite. Un microscopio composto (20-40X obiettivo) dovrebbero essere disponibili per controllare e modificare gli elettrodi prima dell'uso.
  4. Due tipi di soluzioni sono comunemente usati per il bagno durante la dissezione dei tessuti embrionali: 1) "standard" (Jan e Jan, 1976a) o "standard modificato" (Broadie, 2000) saline, basato su soluzioni comunemente usati per la registrazione in altri sistemi di invertebrati , e 2) "emolinfa-like" (HL) saline (Stewart et al 1994), un compromesso tra la soluzione salina standard e le concentrazioni ioniche misurate nella emolinfa Drosophila. Va notato che nessuna di queste saline imitano con precisione la composizione chimica di emolinfa in vivo (Broadie, 2000). Standard di soluzione salina contiene (in mm): 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 1.8 CaCl 2, 72 saccarosio, 5 TES, pH 7,2. Sperimentatori possono anche prendere in considerazione salina insetti preparati commercialmente (ad esempio Schneider Media insetti), che non è adatto per la registrazione elettrofisiologica ma molto probabilmente per proteggere la salute dei tessuti esposti.

Parte 2: Staging Embryo e dissezione

  1. Per la raccolta delle uova ottimale, mantenere giovani (<7 giorni), maschio sano e mosche di sesso femminile (20-40) su cibi freschi vasi che per 2-3 giorni. Pentole posa comunemente costituiti da 100 bicchieri di plastica ml (Tri-Versare) perforata per fornire un'adeguata circolazione dell'aria, che copre una piastra di agar 60 mm. Piastre di agar contenenti mele o succo d'uva indurito con agar. Esistono diverse ricette, ma un esempio è la seguente: 700 ml di acqua, 25-30 grammi di agar, 300 ml di succo concentrato (uva o di mela), 0,5 g metilparaben (p-hydroxymethylbenzoate) e 30g di zucchero. Autoclave l'acqua e agar e far bollire a parte il p-hydroxymethylbenzoate con lo zucchero e il succo. Mescolare l'agar e soluzioni succo di frutta e versare rapidamente in 60 piastre mm, rimuove le bolle.
  2. Prima della raccolta delle uova, le mosche sono alimentati con pasta di lievito (7 grammi di lievito di birra in 9 ml di acqua conservato a 4 ° C) su piatti freschi, cambiata almeno due volte al giorno per almeno due giorni. Di giorno 3, un piatto buono dovrebbe produrre 100-200 uova all'ora. Deposizione delle uova migliore si osserva in una pentola mantenuto su un lato con l'agar nella piastra graffiato. Molti embrioni saranno stabilite nel o accanto ai graffi.
  3. Per raccogliere un gran numero di embrioni, delicatamente trasferire gli embrioni dalla piastra di agar in un cesto con un pennello. Un cesto può essere fatto con un tubo da 15 o 50 ml per centrifuga. Tagliare la parte inferiore lasciando spazio sufficiente superficie per intrappolare uno schermo (70 mesh micron) tra il coperchio e la parte superiore del tubo. Sciacquare gli embrioni con dH 2 0 e messo in una piastra di Petri di fresco 50% al 100% di candeggina per rimuovere il corion esterno. In alternativa, le uova possono essere raccolti individualmente utilizzando una pinza sottile, e dechorionated mettendoli manualmente in una goccia di candeggina. De-chorionation può richiedere da 30 secondi a 2 minuti (candeggina fresca è molto più veloce), e devono essere monitorati sotto il microscopio di dissezione. La rimozione del corion espone la lucida, trasparente membrana vitellina. Dechorionated uova devono essere brevemente sciacquati, o posto in soluzione fisiologica, come candeggina distrugge rapidamente i tessuti devitellinized.
  4. E 'fondamentale mettere in scena con attenzione embrioni per l'età evolutiva desiderato. La Drosophila definito stadio embrionale (1-17; Campos-Ortega e Hartenstein, 1985) non sono utili, come tutto lo sviluppo funzionale neuromuscolare avviene in fase avanzata o 16 stadio 17. Così, gli embrioni sono messo in scena da ora dello sviluppo a 25 ° C in un incubatore umidificato, in ore dopo la fecondazione o, più comunemente, dopo la deposizione delle uova (AEL). In queste condizioni, l'embriogenesi dura 21 + / - 1 ora a 25 ° C.
  5. Uova da un tempo di uovo laici (1-2 hrs) che sono opportunamente invecchiato sono visti per la prossima criteri morfologici. Dopo il lavaggio in ampia dH 2 O, le uova dechorionated sono posti in un piatto di plastica cultura (sotto dH 2 O) per la visualizzazione. Corretta stadiazione può essere confermata con criteri morfologici usando la luce riflessa con un microscopio a dissezione (Campos-Ortega e Hartenstein, 1985). Maturo fase avanzata embrioni (22-24h AEL) sul punto di cova sono generalmente riconosciuti dalla segmentazione della cuticola e trachea gonfiati. Gli embrioni possono anche essere sottoposti a tipizzazione mediante GFP e bilanciatori di dissezione di un microscopio a fluorescenza con filtri appropriati.
  6. Per la dissezione, embrioni dechorionated ed evolutivamente messo in scena sono fissati (lato dorsale verso l'alto) su un vetrino con una goccia di soluzione salina (vedi punto 1.5). Gli embrioni vengono rimosse dalla membrana vitellina da pungere la membrana verso la fine anteriore o posteriore, con una micropipetta di vetro o un ago di tungsteno, e poi delicatamente liberando l'embrione dalla membrana. In preparazione per la dissezione, l'embrione deve essere posizionato sul vetrino con la superficie dorsale up (lato dorsale fino dissezione esporrà il sistema nervoso ventrale e neuromusculature per gli esperimenti. Tuttavia, l'embrione può ovviamente essere posizionati in altri modi per facilitare l'accesso ad altri tessuti.)
  7. Embrioni stadio precoce (<16 ore AEL) attaccano direttamente alla pulizia vetro o vetro rivestiti con polilisina (poli-L-lisina bromidrato; Broadie e Bate, 1993a, b). Vecchi embrioni (> 16 ore AEL), a seguito di formazione cuticola, deve essere incollato, idealmente Sylgard rivestite (Dow Corning) coprioggetto. Un'acqua-polimerizzazione colla cianoacrilato chirurgico o veterinario viene utilizzata (Broadie e Bate, 1993c, d). La colla è espresso attraverso una pipetta piccolo elettrodo di vetro (10-20 micrometri punta diametro interno) collegato ad un tubo di gomma con la colla flusso controllato dalla pressione bocca. Si deve prestare attenzione durante il parto colla, come la colla polimerizza rapidamente dopo il contatto con soluzione salina. Si noti inoltre che l'incollaggio non può essere eseguita in soluzione salina con nessuna o scarsa concentrazione di ioni bivalenti, come il collante necessario per polimerizzare gli ioni bivalenti. Piccole quantità di colla prima utilizzazione per fissare saldamente la testa e la coda.
  8. Una volta che le estremità dell'embrione sono incollati al vetrino, un'incisione è fatta lungo la linea mediana dorsale con un elettrodo di vetro o un ago di tungsteno affilata. Ciò è reso più facile da dolci perforando la linea di incisione prima di effettuare il taglio finale. I lati dell'incisione vengono poi attaccato al vetrino con più colla, per diffondere delicatamente il piatto embrione. Gli organi interni tra cui l'intestino, i corpi grassi e, facoltativamente, trachea vengono eliminati tramite aspirazione con una pipetta di vetro collegato al tubo di gomma (Broadie e Bate 1993a-c). L'embrione dovrebbe essere allegato al piano coprioggetti, epidermide giù con la ventrale sistema nervoso centrale, nervi periferici, e somatiche muscolatura esposta per la sperimentazione.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Precisa stadiazione di embrioni è critica a causa della rapida maturazione delle proprietà funzionali nel corso del tempo solo diverse ore. Diversi problemi complicare questa messa in scena. In primo luogo, molti ricercatori utilizzano uovo tempo stabilisce per gli embrioni palco, ma il tempo di deposizione delle uova può variare enormemente da animale ad animale in condizioni diverse (Broadie et al. 1992). In particolare, le femmine con una dieta limitata tendono a conservare le uova fecondate per periodi prolungati pr...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ringraziamenti

KB è supportato dal NIH concedere GM54544.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Recipienti per raccolta di embrioniGenesee Scientific59-100 (per piatto da 60 mm; disponibili altre dimensioni)I recipienti possono anche essere realizzati in laboratorio utilizzando becher tri-pour forati, come mostrato nel video
Sylgard 184Dow CorningDisponibile da diverse aziendeLa colla chirurgica aderisce meglio a coprioggetti rivestiti con Sylgard
Microcapillari di vetro, diametro esterno 1,0-1,5 mmVariePer essere tirati a formare aghi di vetro sottili per dissezione e tubi per l'applicazione della colla
Tubino di plastica, da collegare alla pipetta di vetro per aspirazione orale e applicazione della collaTygonIl diametro interno del tubino deve corrispondere al diametro esterno del vetro.

Riferimenti

  1. Aravamudan, B., Fergestad, T., Davis, W. S., Rodesch, C. K., Broadie, K. Drosophila UNC-13 is essential for synaptic transmission. Nat. Neurosci. 2, 965-971 (1999).
  2. Auld, V. J., Fetter, R. D., Broadie, K., Goodman, C. S. Gliotactin a novel transmembrane protein on peripheral glia, is required to form the blood-nerve barrier in Drosophila. Cell. 81, 757-767 (1995).
  3. Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
  4. Baines, R. A., Robinson, S. G., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Postsynaptic expression of tetanus toxin light chain blocks synaptogenesis in Drosophila. Curr. Biol. 9, 1267-1270 (1999).
  5. Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
  6. Bate, M. The embryonic development of the larval muscles in Drosophila. Development. 110, 791-804 (1990).
  7. Bate, M., Martinez Arias, A. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Vol. I, II (1993).
  8. Baumgartner, S., JT, L. ittleton, Broadie, K., MA, B. hat, Harbecke, R., JA, L. engyel, Chiquet-Ehrismann, R., Prokop, A., Bellen, H. J. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87, 1059-1068 (1996).
  9. AH, B. rand Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  10. Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
  11. Broadie, K. Electrophysiological Approaches to the Neuromusculature. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 273-296 (2000).
  12. Broadie, K., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 144-166 (1993a).
  13. Broadie, K., Bate, M. Development of larval muscle properties in the embryonic myotubes of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 167-180 (1993b).
  14. Broadie, K., Bate, M. Activity-dependent development of the neuromuscular synapse during Drosophila embryogenesis. Neuron. 11, 607-619 (1993c).
  15. Broadie, K., Bate, M. Synaptogenesis in the Drosophila embryo: innervation directs receptor synthesis and localization. Nature. 361, 350-353 (1993d).
  16. Broadie, K., Bellen, H. J., DiAntonio, A., Littleton, J. T., Schwarz, T. L. The absence of Synaptotagmin disrupts excitation-secretion coupling during synaptic transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10727-10731 (1994).
  17. Broadie, K., Prokop, A., Bellen, H. J., O'Kane, C. J., Schulze, K. L., Sweeney, S. T. Syntaxin and Synaptobrevin function downstream of vesicle docking in Drosophila. Neuron. 15, 663-673 (1995).
  18. Broadie, K., Rushton, E., Skoulakis, E. C. M., Davis, R. L. eonardo a 14-3-3 protein involved in learning, regulates presynaptic function. Neuron. 19, 391-402 (1997).
  19. Broadie, K., Skaer, H., Bate, M. Whole-embryo culture of Drosophila: development of embryonic tissues in vitro. Roux's Arch. Develop. Biol. 201, 364-375 (1992).
  20. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
  21. Deitcher, D. L., Ueda, A., Stewart, B. A., Burgess, R. W., Kidokoro, Y., Schwartz, T. L. Distinct requirements for evoked and spontaneous release of neurotransmitter are revealed by mutations in the Drosophila gene neuronal-synaptobrevin. J. Neurosci. 18, 2028-2039 (1998).
  22. Featherstone, D. E., Broadie, K. Surprises from Drosophila: genetic mechanisms of synaptic development and plasticity. Brain Res. Bull. 53, 501-511 (2000).
  23. Featherstone, D. E., Rushton, E. M., Hilderbrand-Chae, M., Phillips, A. M., Jackson, F. R., Broadie, K. Presynaptic glutamic acid decarboxylase is required for induction of the postsynaptic receptor field at a glutamatergic synapse. Neuron. 27, 71-84 (2000).
  24. Featherstone, D. E., Davis, W. S., Dubreuil, R. R., Broadie, K. Drosophila alpha- and beta-spectrin mutations disrupt presynaptic neurotransmitter release. J Neurosci. 21, 4215-4224 (2001).
  25. Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nat Neurosci. 5, 141-146 (2002).
  26. Featherstone, D. E., Rushton, E., Rohrbough, J., Liebl, F., Karr, J., Sheng, Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. An essential Drosophila glutamate receptor subunit that functions in both central neuropil and neuromuscular junction. J. Neurosci. 25, 3199-3208 (2005).
  27. Fergestad, T., Davis, W. S., Broadie, K. The stoned proteins regulate synaptic vesicle recycling in the presynaptic terminal. J Neurosci. 19, 5847-5860 (1999).
  28. Fergestad, T., Wu, M. N., Schulze, K. L., Lloyd, T. E., Bellen, H. J., Broadie, K. Targeted mutations in the syntaxin H3 domain specifically disrupt SNARE complex function in synaptic transmission. J Neurosci. 21, 9142-9150 (2001).
  29. Fergestad, T., Broadie, K. Interaction of stoned and synaptotagmin in synaptic vesicle endocytosis. J Neurosci. 21, 1218-1227 (2001).
  30. Goodman, C. S., Doe, C. Q. Embryonic Development of the Drosophila Central Nervous System. In The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 1131-1206 (1993).
  31. Harrison, S. D., Broadie, K., Goor, J. vande, Rubin, G. M. Mutations in the Drosophila Rop gene suggest a function in general secretion and synaptic transmission. Neuron. 13, 555-566 (1994).
  32. Huang, F. D., Woodruff, E., Mohrmann, R., Broadie, K. Rolling blackout is required for synaptic vesicle exocytosis. J. Neurosci. 26, 2369-2379 (2006).
  33. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  34. Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. J. Physiol. 262, 215-236 (1976b).
  35. Kidokoro, Y., Nishikawa, K. I. Miniature endplate currents at the newly formed neuromuscular junction in Drosophila embryos and larvae. Neuroscience Research. 19, 143-154 (1994).
  36. Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. J. Neurosci. 17, 9642-9655 (1997).
  37. Mohrmann, R., Matthies, H. J., Woodruff III, E., Broadie, K. Stoned B mediates sorting of integral synaptic vesicle proteins. Neuroscience. 153, 1048-1063 (2008).
  38. Nishikawa, K. I., Kidokoro, Y. Junctional and extrajunctional glutamate receptor channels in Drosophila embryos and larvae. J. Neurosci. 15, 7905-7915 (1995).
  39. Renden, R., Berwin, B., Davis, W., Ann, K., Chin, C. T., Kreber, R., Ganetzky, B., Martin, T. F., Broadie, K. Drosophila CAPS is an essential gene that regulates dense-core vesicle release and synaptic vesicle fusion. Neuron. 31, 421-437 (2001).
  40. Rohrbough, J., Broadie, K. Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission in Central Neurons of Drosophila Larvae. J. Neurophysiol. 88, 847-860 (2002).
  41. Rohrbough, J., Rushton, E., Palanker, L., Woodruff, E., Matthies, H. J., Acharya, U., Acharya, J. K., Broadie, K. Ceramidase regulates synaptic vesicle exocytosis and trafficking. J. Neurosci. 24, 7789-7803 (2004).
  42. Rohrbough, J., Rushton, E., Woodruff, E. 3rd, Fergestad, T., Vigneswaran, K., Broadie, K. Presynaptic establishment of the synaptic cleft extracellular matrix is required for postsynaptic differentiation. Genes Dev. 21, 2607-2628 (2007).
  43. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J. Comp. Physiol.. A175, 179-191 (1994).
  44. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
  45. Tsunoda, S., Salkoff, L. Genetic analysis of Drosophila neurons: Shal, Shaw, and Shab encode most embryonic potassium currents. J. Neurosci. 15, 1741-1754 (1995).
  46. Ueda, A., Kidokoro, Y. Longitudinal body wall muscles are electrically coupled across the segmental boundary in the third instar larva of Drosophila melanogaster. Invertebrate Neuroscience. 1, 315-322 (1996).
  47. Wu, C. F., Haugland, F. N. Voltage clamp analysis of membrane currents in larval muscle fibers of Drosophila. J. Neurosci. 5, 2626-2640 (1985).
  48. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. J Neurosci Methods. 162, 198-205 (2007).
  49. Yoshikami, D., Okun, L. Staining of living presynaptic nerve terminals with selective fluorescent dyes. Nature. 310, 53-56 (1984).
  50. Zagotta, W. N., Brainard, M. S., Aldrich, R. W. Single-channel analysis of four distinct classes of potassium channels in Drosophila muscle. J. Neurosci. 8, 4765-4779 (1988).
  51. Zhang, Y. Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. A living synaptic vesicle marker: synaptotagmin-GFP. Genesis. 34, 142-145 (2002).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Raccolta degli embrioniapplicazione di colla chirurgicacordone nervoso ventralemuscolatura della parete corporearimozione degli organi internimicroscopio da dissezionegenotipizzazione a fluorescenzacolla cianoacrilica
Raccolta e Preparazione Drosophila Gli embrioni per la registrazione elettrofisiologici e altre procedure
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.