La normalizzazione nata per fluorescenza Tomografia Ottica proiezione per l'imaging tutto il cuore

Summary

Vi suggeriamo un approccio Nato normalizzato per Tomografia Ottica di proiezione (BnOPT) che rappresenta la proprietà di assorbimento dei campioni ripreso ad ottenere ricostruzioni fluorescenza accurata e quantitativa tomografica. Usiamo l'algoritmo proposto di ricostruire la distribuzione della fluorescenza della sonda molecolare all'interno di organi di animali di piccole dimensioni.

Abstract

Tomografia ottica di proiezione è un tridimensionale tecnica di imaging che è stato recentemente introdotto come strumento di imaging principalmente in biologia dello sviluppo e studi di espressione genica. La tecnica rende campione biologico otticamente trasparente prima li disidratazione e poi messa in una miscela di alcool benzilico e benzoato benzilico in un rapporto di 2:1 (BABB o Murray soluzione s FTA). La tecnica rende campioni biologici otticamente trasparente prima li disidratazione in soluzioni di etanolo graduato allora per questi ultimi in una miscela di alcool benzilico e benzoato benzilico in un rapporto di 2:1 (BABB o Soluzione limpida Murray s) per cancellare. Dopo il processo di compensazione il contributo di scattering nel campione può essere notevolmente ridotto e reso quasi trascurabile, mentre il contributo di assorbimento non può essere eliminato completamente. Quando si tenta di ricostruire la distribuzione della fluorescenza all'interno del campione in esame, questo contributo riguarda le ricostruzioni e conduce, inevitabilmente, ad artefatti ed errori di quantificazione .. Mentre l'assorbimento potrebbero essere ridotti ulteriormente con una permanenza di settimane o mesi nei media radura, questo porterà ad una perdita progressiva di fluorescenza e ad un tempo di campionamento irrealisticamente lunghi di elaborazione. Questo è vero quando ricostruendo sia agenti di contrasto esogeni (agenti di contrasto molecolare), così come il contrasto endogeni (ad esempio, ricostruzioni di espressione genetica delle proteine ​​fluorescenti).

Protocol

Procedura di imaging

Il setup sperimentale è mostrato in dettaglio nella Figura 1. Una sorgente di luce LS serve sia come illuminazione per misure di assorbimento e come fonte di eccitazione per misure di fluorescenza ed è filtrata con una stretta banda passante BPF filtro di interferenza. Un insieme di ND densità fissi e variabili neutro filtri combinati con la presenza di un otturatore automatico S permettono di controllare la quantità di luce sul campione e di tenerlo abbastanza basso per evitare photobleaching. Illuminazione campione uniforme si ottiene utilizzando un espansore fascio ESSERE con una combinazione di due lenti cannocchiale galileiano e un diffusore. Il campione S è immerso nella soluzione di compensazione e viene tenuta in posizione su un supporto e ruotato lungo il suo asse verticale per mezzo di uno stadio ad alta velocità di rotazione (Newport, PR50) con una precisione assoluta di 0,05 gradi. Tre controller manuale distinti consentono l'asse verticale del campione a essere inclinato e regolato nel suo piano ortogonale. Il segnale transilluminazione è direttamente rilevata dalla telecamera CCD, il segnale di fluorescenza viene filtrato attraverso una stretta filtro passa-banda interferenze accoppiata con un filtro longpass (Omega. Optical, Brattleboro, VT) e poi raccolto con una lente telecentrico TL. Telecentrici offrono il vantaggio di fornire caratteristiche uniche che li rendono ideali per la tomografia ottica di proiezione. Infatti la presenza di una apertura fermata situata all'interno del gruppo ottico nel punto focale della lente assicura che i raggi, che rendono l'immagine del diaframma, viaggerà parallelamente all'asse ottico eliminando le distorsioni di prospettiva e di fornire lo stesso ingrandimento per più piani all'interno della profondità telecentrico.

Preparazione del campione

La seguente procedura è seguita per riparare i tessuti / organi

1. Campioni vengono fissati in PFA per 8 ore a 4C.
2. Campione viene poi lavato in PBS per 15 minuti
3. Il campione è immerso in un blocco di 0,8% di agarosio
4. Agarosio blocco è disidratato attraverso una serie di 20% al 100% delle soluzioni di etanolo. Questa disidratazione procedura di etanolo aiuta ad evitare ogni restringimento asimmetrico del campione.
5. Infine il campione viene incubato a 10 ore per il 100% di etanolo al fine di rimuovere qualsiasi contenuto l'acqua dal campione.
6. Mettere il campione in una soluzione 1:02 di alcool benzilico e benzoato di benzile per il tempo necessario per il campione da cancellare. Si noti che il tempo può variare notevolmente da campione a campione da poche ore a diversi giorni.
7. Etanolo in minime tracce possono essere presenti al termine del processo di compensazione dando luogo a tagliare artefatti nelle ricostruzioni dovuta al moto termico degli alcolici all'interno della soluzione di compensazione stessa. Per evitare questo problema, un ciclo di compensazione secondo raccomandata.
8. Punto 4 e 5 devono essere effettuate al buio per evitare qualsiasi sbiancamento di mezzi di contrasto fluorescente o proteine.

Cuore Preparazione del campione

E 'importante rimuovere qualsiasi contenuto in qualsiasi tessuto del sangue prima di essere ripreso in modo da evitare artefatti alto assorbimento nelle ricostruzioni. La seguente procedura può essere seguita.

1. Anestetizzare il mouse con un'iniezione intraperitoneale (IP) di un mix di ketamina (90 mg / kg) e xilazina (10mg/kg).
   Nota: ". Da questo punto in avanti conservare il campione al riparo dalla luce"
2. Iniettare 50 U di eparina (IP) e cinque minuti dopo, eseguire una laparotomia longitudinale.
3. Aprire la vena renale sinistra (LRV) e infondere 20 ml di soluzione salina nel IVC.
4. Il blocco di agarosio deve essere disidratato con quattro, incubazioni un'ora, nel 20%. 40%, 60% e 80% di etanolo, e poi finalmente, i campioni sono incubati in 100% di etanolo per 10 ore (una notte).
5. Cuore è poi fissato seguendo la procedura generale di preparazione del campione
   Nota: ". Da questo punto in avanti conservare il campione al riparo dalla luce"

Ricostruzioni assorbimento

Ricostruzione di assorbimento ottico in assenza di dispersione sono, in generale, analogo a X-CT e può essere ottenuto mediante un algoritmo di retroproiezione filtrata comune Radon. Le immagini assorbimento sono poi presa da una telecamera CCD in transilluminazione oltre 360 ​​proiezioni, con un angolo di 1 grado lungo l'asse verticale. E 'conveniente per allineare l'asse verticale del campione parallelo alla colonna di pixel del CCD.

1. Posizionare il blocco di agarosio in una camera riempita con una soluzione di compensazione
2. Illuminare campione con un fascio collimato sia per l'eccitazione e le misure di trasmissione
3. Ruotare il campione oltre 360 ​​proiezioni, con un angolo di 1 grado.
4. Acquisire immagini in transilluminazione, sia di assorbimento (intrinseca) e lunghezze d'onda di fluorescenza.
5. Posizionare un otturatore per evitare l'illuminazione continua e ridurre lo sbiancamento.
6. Usa afiltered algoritmo di retroproiezione Radon per ricostruire tomographically il campione

Ricostruzioni fluorescenza

L'algoritmo usato per le ricostruzioni l'assorbimento non è valido per la ricostruzione della distribuzione fluorescenza e, se non presa in considerazione, il contributo assorbimento porterà ad artefatti grave.

1. Procedere come indicato nel "Absoprtion ricostruzioni" sezione.
2. Acquisire contemporaneamente sia di assorbimento e misure di fluorescenza
3. Combinare i dati nelle immagini normalizzato campo Nato
4. Scrivere le equazioni del modello in avanti di propagazione della luce per lunghezze d'onda e la fluorescenza intrinseca.
5. Calcola matrice peso su una maglia discretizzato per le funzioni di Green del modello in avanti
6. Invertire la matrice di peso e moltiplicarlo per il rilevato immagini normalizzato campo Nato ad ottenere la ricostruzione della distribuzione fluorescenza nell'oggetto