Ottenere altamente purificato Toxoplasma gondii Oocisti da un gradiente discontinuo di cloruro di cesio

Sommario

Questo studio descrive lo sviluppo di un metodo modificato CsCl che purifica facilmente T. gondii oocisti dalle feci di gatti infetti che sono adatti per biologia molecolare e la cultura manipolazione dei tessuti

Abstract

Toxoplasma gondii è un protozoo intracellulare obbligato patogeno che infetta i comuni esseri umani. Si tratta di un Apicomplexa ben caratterizzato associati causando epidemie alimentare e idrica. L'ospite definitivo è la specie felina in cui la replica sessuale si verifica con conseguente sviluppo delle oocisti altamente infettiva e ambientale resistente. L'infezione avviene attraverso l'ingestione di cisti tessuto da carni contaminate o oocisti dal suolo o acqua. L'infezione è generalmente asintomatica nei soggetti sani, ma i risultati in una vita lunga infezione latente che può riattivare toxoplasmic causare l'encefalite e la morte se l'individuo diventa immunocompromessi. Carne contaminata con T. cisti gondii sono stati la fonte primaria di infezione in Europa e negli Stati Uniti, ma i recenti cambiamenti nella gestione degli animali e le pratiche di allevamento e manipolazione degli alimenti migliorata e le procedure di lavorazione hanno ridotto notevolmente la prevalenza di T. cisti gondii in carne ^{1, 2.} Tuttavia, sieroprevalenza negli esseri umani rimane relativamente elevata suggerisce che l'esposizione da oocisti suolo o acqua contaminati è probabile. Infatti, i focolai all'acqua della toxoplasmosi sono stati segnalati in tutto il mondo a sostegno della teoria esposizione alla forma oocisti ambientale rappresenta un rischio significativo per la salute ^3-5. Ad oggi, la ricerca sulla comprensione della prevalenza di T. oocisti gondii in acqua e l'ambiente sono limitate a causa della mancanza di strumenti per rilevare oocisti nell'ambiente ^{5, 6.} Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di protocolli di purificazione efficiente per ottenere un gran numero di oocisti altamente purificato T gondii da gatti infetti per scopi di ricerca. Questo studio descrive lo sviluppo di un metodo CsCl modificato che purifica facilmente T. gondii oocisti dalle feci di gatti infetti che sono adatti per biologia molecolare e della cultura manipolazione dei tessuti ^7.

Protocollo

1. Precauzioni generali di sicurezza quando si lavora con T. gondii Oocisti

1. E 'importante seguire tutte le precauzioni di sicurezza quando si lavora con T. gondii Oocisti. Nella maggior parte degli individui sani, T. gondii è facilmente controllato dal sistema immunitario, ma per tutta la vita i risultati infezione. Soggetti immunocompromessi sono particolarmente suscettibili di toxoplasmosi e non dovrebbe maneggiare T. gondii Oocisti. Le donne incinte non devono anche gestire T. gondii Oocisti, perché l'infezione può causare gravi difetti alla nascita ⁸.
T. gondii Oocisti deve essere manipolato in uno spazio delimitato e con personale addestrato. Segnali che indicano T. gondii Lavoro oocisti è in corso devono essere inviati ad avvisare gli altri entrare nella zona designata.
2. Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) come un camice da laboratorio, camice monouso, guanti monouso e protezione per gli occhi o una maschera per il viso durante la manipolazione T. gondii Oocisti.
frequenti sono raccomandati. Non maneggiare qualsiasi attrezzatura di laboratorio con T. gondii Oocisti contaminati guanti.
3. Usare sempre vassoi di metallo autoclavabile rivestito con un liner assorbente usa e getta quando si lavora con T. gondii Oocisti. Assicurarsi che tutti i rack, tubi, ecc utilizzati sono sia monouso o autoclavabili.
4. Tutti i T. gondii devono essere sterilizzati in autoclave due volte per almeno un'ora.
5. Tutti i materiali riutilizzabili (rack, vassoi, ecc) devono essere sterilizzati in autoclave due volte per almeno un'ora.
6. Linee di vuoto usato per aspirare i liquidi deve essere collegato ad un ™ Vacushield filtro per evitare la contaminazione della pompa per vuoto.
7. Tutti di laboratorio affetti da banco cime devono essere disinfettati dopo aver completato il lavoro con T. gondii Oocisti. Appena fatto ipoclorito 10% deve essere adottata per l'area di lavoro e ha permesso a secco. L'area deve essere sciacquato con acqua.

2. Preparazione di tamponi e soluzioni

1. Preparare una soluzione L 1 2,2 M di saccarosio sciogliendo 752,66 g di saccarosio in 600 ml di DDH ₂ O. Mescolate delicatamente e calore utilizzando una piastra riscaldata mescolare per sciogliere il saccarosio. Una volta completamente sciolto, portare al volume di 1 L con DDH ₂ O. Questo dovrebbe essere seguita da sterilizzazione in autoclave la soluzione per almeno 20 minuti.
2. Preparare una 1L tampone TE (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA), a pH 7,2 con l'aggiunta di 6,05 g di Tris-HCl e 3,7 g di EDTA in 700 ml di DDH ₂ O, regolare il pH a 7,2 quindi portare al volume di 1 L con DDH ₂ O.
3. Per il gradiente di CsCl, preparare una soluzione stock di CsCl, con un peso specifico di 1,15 (1,15-CsCl) con l'aggiunta di 21,75 g di CsCl con 103,25 ml di tampone TE. Per la soluzione A, miscelare 30 ml di TE con 20 ml di 1,15-CsCl. Per la soluzione B, mescolare 20 ml di TE con 30 ml di 1,15-CsCl e 12,5 ml di soluzione di rosso fenolo. Per Soluzione C, miscelare 10 ml di TE con 40 ml di 1,15-CsCl (Tabella 1).
4. Preparare una 1L soluzione 1 N di idrossido di sodio (NaOH), sciogliendo 40 g di NaOH, in 800 ml di DDH ₂ O. Una volta sciolto, portare al volume di 1 L con DDH ₂ O.
5. Preparare una soluzione 1 L 2% (in volume) di H ₂ SO ₄ Mescolando 20 ml di H ₂ SO ₄ Con 980 ml di DDH ₂ O.

3. Saccarosio galleggiante

1. Aggiungi 10 ml di una sospensione fecale di T. gondii Oocisti, nel 2% H ₂ SO ₄, In una provetta da centrifuga 50 ml. Si deve notare che la sospensione si riferisce a campioni fecali che sono stati pre-elaborati attraverso una procedura di galleggiamento saccarosio come descritto in precedenza ⁸. Quando i campioni di feci sono inizialmente raccolte dai gatti infetti sono elaborati attraverso un galleggiante saccarosio come descritto in riferimento 8. Questo galleggiante saccarosio supplementare è necessario per minimizzare ulteriormente i residui fecali riportati al processo di purificazione CsCl e ottenere il più puro T. gondii Oocisti possibile.
2. Neutralizzare l'H 2% ₂ SO ₄ Con l'aggiunta di 6 ml (3 / 5 volumi) di 1 N NaOH alla sospensione fecale. Mescolare bene nel vortex.
3. Aggiungi un uguale volume (16 ml) di 2,2 M saccarosio creando una concentrazione finale di 1,1 M per la sospensione fecale e mescolare bene nel vortex.
4. Cautela sovrapporre il saccarosio / sospensione fecale con 10 ml di DDH ₂ O con una pipetta 10 ml. Centrifugare la sospensione a 1.200 xg per 20 minuti a temperatura ambiente senza alcun freno.
5. Raccogliere accuratamente l'acqua in alto e gli strati interfase e trasferirli in un nuovo tubo da 50 ml per centrifuga pipettando dal cielo-acqua, senza vorticosa la pipetta. E 'importante ridurre al minimo riporto saccarosio raccogliendo lo strato interfase.
6. Mescolare la restante saccarosio / fecale soluzione pellet vortexando il tubo.
passi 3.4 e 3.5.
7. Portare il volume delle soluzioni oocisti due interfase a 50 ml con DDH ₂ O e centrifugare le provette a 2000 xg per 10 minuti a temperatura ambiente.
8. Aspirare il surnatante da ogni provetta e pellets risospendere con 5 ml di tampone TE e la piscina la sospensione oocisti insieme. Il volume totale pool dovrebbe essere di 10 ml.

4. Gradiente di CsCl

1. Preparazione di un gradiente discontinuo CsCl in un tubo da 50 ml in policarbonato Oak Ridge con attenzione ogni strato sottostante mediante una siringa da 50 ml con un calibro 18 blunt-ended, autoclavabile, ago in acciaio, e un rubinetto a 2 vie. Nota: il rosso fenolo è aggiunto alla soluzione B di distinguere facilmente tra gli strati di pendenza (tabella 1).
2. Aggiungere lentamente le seguenti soluzioni per il tubo nell'ordine elencato di seguito. Va notato che la portata non deve superare più di 0,5 ml / sec.
   1. 10 ml di TE / oocisti campione sospensione
   2. 8 ml Soluzione A
   3. 8 ml di soluzione B
   4. 8 ml Soluzione C
3. Centrifugare la provetta Oak Ridge a 12.000 xg per 60 minuti a 4 ° C senza freno. L'utilizzo di un rotore ad angolo fisso è accettabile, ma ad alta velocità oscillante risultati secchio in una migliore separazione delle oocisti dal campione sospensione con un minimo strisci fecali detriti lungo il fianco o il tubo. L'entità del strisci dipende dalla composizione della sospensione fecale e quindi potrebbe essere necessario eseguire due gradienti di CsCl se la sospensione fecale è molto sporco.
4. Dopo centrifugazione, raccogliere l'opaco / bianco fascia oocisti contenente tra le soluzioni A e B. Per minimizzare la contaminazione con residui fecali, passare direttamente alla band oocisti senza disturbare il gradiente e raccogliere l'interfase oocisti con una pipetta 10 ml. Trasferire il oocisti interfase a un nuovo tubo da centrifuga da 50 ml. Cercare di minimizzare la quantità di soluzione CsCl aspirato, mentre la raccolta dei oocisti interfase perché potrebbe essere un problema in cubettatura le oocisti durante la fase di lavaggio.
5. Lavare le oocisti con 30-40 ml di DDH ₂ O. Centrifugare la provetta a 2.000 xg a temperatura ambiente per 10 minuti senza freno. Con attenzione aspirare il sopranatante senza disturbare il pellet oocisti. Ripetere il lavaggio due volte.
6. Alla fine l'ultimo lavaggio, accuratamente aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 10 ml di acido solforico al 2% e conservare a 4 ° C fino all'uso. Oocisti sono ora pronti per ulteriori manipolazioni. Purezza oocisti possono essere controllati al microscopio per l'assenza di residui fecali nel campione.