Adulti miociti cardiaci sono cellule primarie che possono essere isolati da cuori animali e coltivate per diversi giorni. In questo periodo la cultura trasferimento genico adenovirali possono essere usate per esprimere biosensori geneticamente codificato (GEBS) o proteine di fusione fluorescenti. Entrambi gli approcci consentono indagini cellulari mediante microscopia confocale.
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Articolo metodologico
L'isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging
In questo articolo
Sommario
Abstract
Miociti cardiaci isolati da cuori adulti sono ampiamente accettate come un modello da qualche parte a metà strada tra le cellule muscolari embrionali e neonatale da un lato e un cuore lavoro, dall'altro. Così, cardiomiociti servire come buoni modelli per cardiache fisiologia e fisiopatologia cellulare, per le indagini farmaceutica e per l'esplorazione di modelli animali transgenici. Qui si descrive un metodo per isolare le cellule del cuore. Inoltre si mostra come una manipolazione genetica su miociti cardiaci possono essere eseguiti senza allevare un animale transgenico: Questa è la combinazione della cultura a lungo termine (1 settimana) e il trasferimento di geni adenovirali. Che quest'ultima sia descritto dalla costruzione del virus per la trasduzione delle cellule. Può essere utilizzato per l'espressione di biosensori geneticamente codificato (GEBS), proteine di fusione fluorescenti, ma anche per le proteine oltre espressione e giù per regolamento, ad esempio utilizzando RNAi. Qui abbiamo un esempio per l'espressione di una proteina di fusione colorazione una struttura subcellulare (Golgi). Espressione di tali proteine possono essere visualizzate da imaging confocale di z-stack per una ricostruzione 3D di strutture subcellulari. Il protocollo comprende state-of-the-art in coltura cellulare, biologia molecolare e di biofisica e fornisce quindi un metodo per esplorare nuovi orizzonti in cardiologia cellulare.
Protocollo
Gli oltre ogni disegno del protocollo contenente quattro fasi principali è rappresentato in figura 1. Tutte le fasi sono descritte in dettaglio. Isolamento delle cellule, la trasduzione e la cultura, seguita da confocale circa 24 ore è poi un consecutivi e obbligatoria tempi. La costruzione del virus dovrebbe essere fatto in anticipo l'isolamento delle cellule e viene quindi utilizzato per la trasduzione genetica.
1. Isolamento dei miociti cardiaci da adulti cuore di ratto
- Adulto ratti maschi Wistar circa 250 g di peso (6-12 settimane di età) sono anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di 170 ul di soluzione anes....
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Discussione
La procedura descritta per l'isolamento dei cardiomiociti di ratto può essere adattato ad altre specie, ad esempio, il mouse 4, se necessario. Un parametro che ha bisogno di adattamento è il mix di enzimi per la digestione (vedi sotto) e anche la durata della digestione. Essere consapevoli del fatto che le cellule di alcune specie (topo per esempio) potrebbe essere più fragile di altri (ad esempio, ratto).
La scelta di collagenasi è probabilmente il passo più importante nella .......
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Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation tedesco (DFG) e dall'Istituto federale per la valutazione dei rischi (BfR, Germania).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione anestetica | Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun) | Miscela di 1 ml di Ursotamin (100 mg/ml di cloridrato di ketamina) e 240 μl Rompun (2% cloridrato di xilazina) | |
| Soluzione di citrato | 117,64 mg di citrato di sodio in 10 ml di soluzione di NaCl 0,9% | ||
| Soluzione A | 134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucosio, 1,2 mM MgSO₄4, 1,2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH aggiustato a 7,35 utilizzando NaOH 10 M, filtrato sterilemente | ||
| Soluzione A+ | Contenuto della soluzione A più 0,2 mM di EGTA, pH aggiustato a 7,35 utilizzando NaOH 10 M, filtrata in condizioni sterili | ||
| Soluzione Liberase | F. Hoffmann‐ La Roche Ltd. | 11988476 001 | 500 μsoluzione madre in 15 ml di soluzione A (soluzione madre: Liberase Blendzyme 4 a 10 mg/ml in acqua deionizzata) |
| Soluzione B | Contenuto della soluzione A più 200 μM CaCl2 e soluzione di DNasi allo 0,1% | ||
| Soluzione B1/2 | Miscela 1:1 di soluzione A e soluzione B | ||
| soluzione di DNasi | Sigma-Aldrich | D4527 | Deossiribonucleasi I, tipo 2 da pancreas bovino, 40 KU (15 mg) vengono disciolte in 5 ml di Tris 10 mM‐Tampone HCl, aggiustato a pH = 7,35, contenente in aggiunta: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ditio–eritritolo; questa soluzione viene mescolata con 5 ml di glicerolo |
| Soluzione di proteine della matrice extracellulare (ECM) | Soluzione di proteine della matrice extracellulare (ECM) | E1270 | 1 ml di soluzione madre, così come acquistata, viene diluito con 6 ml di mezzo M199 |
| Mezzo di coltura M199 | PAA Laboratories | E15‐834 | Mezzo M199 integrato con 1 μl/ml soluzione ITS e 20 μl/ml penicillina‐soluzione di streptomicina (5000 unità/ml) |
| Soluzione ITS | 25 mg di insulina, 25 mg di transferrina e 50 μLa soluzione madre di selenito viene disciolta in 5 ml di acqua deionizzata (soluzione madre: 0,5 mg/ml di selenito di sodio in acqua deionizzata). Aggiungere alcune gocce di HCl 1 M fino a ottenere una soluzione limpida. Aliquote possono essere congelate. | ||
| Tyrode | 135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 2 mM MgCl₂2, 10 mM di glucosio, 10 mM di HEPES, pH aggiustato a 7,35 con NaOH 10 M, filtrato sterilemente | ||
| miscela maestra | 5 μl 10×PCR‐Tampone, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl primer forward, 2 μil primer inverso, 1 μl dNTP´s (10 mM ciascuno), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polimerasi per ogni campione | ||
| LB‐Mezzo | 10 g/l triptone, 5 g/l estratto di lievito, 5 g/l NaCl (e 15 g/l agar se utilizzato come mezzo solido), pH 7,0 | ||
| Pac I | New England Biolabs | R0547L | preparazione: 50 μg DNA, 5 μl 10×tampone, 0,5 μl 100×BSA, 0,75 μl Pac I, riempire con H2O fino a volume finale di 50μl |
Riferimenti
- Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, Molecular Imaging II. Licha, K., Lin, C. P. Vol. 7370, SPIE. Bellingham. 737008-737008 (2009).
- Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (20....
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Ristampe e permessi
