Imaging in vivo di Deep strati corticali usando un microprismi

Sommario

Angolo retto microprismi inserita nella neocorteccia del mouse permette l'imaging con profonda di più strati corticali con un punto di vista tipicamente si trovano in fetta. Un millimetro microprismi offrono un ampio campo di vista (~ 900 micron) e risoluzione spaziale sufficiente per risolvere spine dendritiche. Dimostriamo strato di imaging neuronale V e neocorticale imaging vascolare con microprismi.

Abstract

Vi presentiamo un protocollo per l'imaging in vivo di tessuto corticale utilizzando una profonda sonda di imaging del cervello in forma di microprismi. Microprismi sono 1-mm e hanno un rivestimento riflettente l'ipotenusa per consentire riflessione interna di eccitazione e di emissione di luce. La sonda microprismi contemporaneamente più immagini strati corticali con una prospettiva tipicamente visto solo in preparati fetta. Le immagini sono raccolte in un grande campo di vista (~ 900 micron). Inoltre, forniamo i dettagli sulla non-sopravvivenza procedura chirurgica e la configurazione microscopio. Risultati rappresentativi includono immagini dello strato V neuroni piramidali da Thy-1-H YFP topi mostrano il loro dendriti apicali si estende attraverso lo strato superficiale della corteccia e si estende in ciuffi. Risoluzione è stata sufficiente a immagine spine dendritiche nei pressi del soma di strato di neuroni V. Una coda vena iniezione di colorante fluorescente svela l'intricata rete di vasi sanguigni nella corteccia. Scansione lineare di globuli rossi (RBC) che fluisce attraverso i capillari rivela la velocità dei globuli rossi e tassi di flusso possono essere ottenuti. Questa sonda microprismi romanzo è un elegante metodo nuovo e potente di visualizzare profonde strutture cellulari e la funzione corticale in vivo.

Protocollo

Parte 1: Ottica microprismi e l'installazione Microscopio

1. Il microprismi da noi utilizzati sono di 1 mm, ad angolo retto prismi a base di vetro BK7 acquistati dal Optosigma Corporation (Figura 1). Microprismi sono trattati con pinze quando possibile.
2. L'ipotenusa del microprismi è rivestita con argento migliorato per fornire una riflettività superiore al 97% 400-2000 nm. Ciò fornisce riflessione interna sia la luce laser di eccitazione e la fluorescenza emessa.
3. Microprismi sono sempre trattati con pinze quando possibile. I guanti sono indossati in ogni momento a tenere pulito il prisma.
4. Usiamo un custom-built microscopi....

Discussione

Utilizzando un microprismi in un esperimento di imaging è relativamente semplice e offre molti vantaggi per studi in vivo sul neocorteccia. Esempi rappresentativi di questa tecnica includono immagini tratte da topi transgenici che esprimono la proteina fluorescente gialla nello strato V neuroni corticali. Utilizzando microprismi si può vedere una collezione di grandi corpi cellulari piramidali dello strato V, quasi 1 mm sotto la superficie corticale. Visto anche i dendriti apicali che si estendono attraverso tutti gli s.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Con rivestimento riflettente argentato migliorato - (R77)	OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)	055-0010	Con rivestimento riflettente argentato migliorato - (R77)
Fluoresceina-destrano	Sigma-Aldrich	FD70	70 kDa
Obiettivo a immersione in aria, NA 0,28, 4x	Olympus Corporation	XLFLUOR 4x/340
Obiettivo a immersione in aria, NA 0,60, 40x	Olympus Corporation	LUCPLFLN	Con correzione vetrino 0-2 mm