Microfluidica digitale per trattamento automatizzato di proteomica

Sommario

Microfluidica digitale è una tecnica caratterizzata dalla manipolazione di goccioline discreti (~ nL - ml) su una serie di elettrodi con l'applicazione di campi elettrici. E 'adatto per lo svolgimento rapido, sequenziale, miniaturizzati test automatizzati biochimici. Qui riportiamo una piattaforma in grado di automatizzare diverse fasi di lavorazione proteomica.

Abstract

Proteomica clinica è emerso come una disciplina nuova e importante, promettendo la scoperta di biomarcatori che saranno utili per la diagnosi precoce e la prognosi della malattia. Mentre i metodi di proteomica clinica variano ampiamente, una caratteristica comune è la necessità di (i) l'estrazione di proteine ​​da fluidi estremamente eterogenei (ad esempio siero, sangue intero, ecc) e (ii) la trasformazione biochimica vasta prima dell'analisi. Qui riportiamo un nuovo microfluidica digitale (DMF) metodo basato integrando diverse fasi di lavorazione utilizzate in proteomica clinica. Questo comprende l'estrazione di proteine, resolubilization, riduzione, alchilazione e digestione enzimatica. Microfluidica digitale è un fluido microscala gestione tecnica in cui vengono manipolate le goccioline nanoliter-microlitro dimensioni su una superficie aperta. Le goccioline sono posizionati sulla parte superiore di un array di elettrodi che sono rivestite da uno strato dielettrico - quando un potenziale elettrico viene applicato la goccia, le spese si accumulano su entrambi i lati del dielettrico. Le accuse fungono da maniglie elettrostatiche che possono essere utilizzati per controllare la posizione delle gocce, e da una sequenza di polarizzazione di elettrodi in serie, le gocce possono essere fatte fare a meno, spostare, unire, miscelare, e dividere in superficie. Pertanto, DMF è una scelta naturale per il trasporto rapido, sequenziale, multistep, miniaturizzati test automatizzati biochimici. Questo rappresenta un significativo passo avanti rispetto ai metodi tradizionali (affidamento su pipettaggio manuale o robot), e ha il potenziale per essere un utile strumento nuovo in proteomica clinica.

Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, e Steve CC Shih contribuito in maniera uguale a questo lavoro.

Indirizzo attuale Sergio LS Freire è presso l'Università delle Scienze di Filadelfia situato a 600 South 43 Street, Philadelphia, PA 19104.

Protocollo

Parte 1: fabbricazione del dispositivo

1. Substrati di vetro pulito in soluzione Piranha (3:1 conc acido solforico. Perossido di idrogeno 30%). Lasciare i substrati in soluzione Piranha per 10 minuti sotto agitazione.
2. Dopo il risciacquo in acqua deionizzata (DI) acqua e asciugare i substrati con N ₂ gas, posizionare i substrati all'interno della camera fascio di elettroni per la deposizione di cromo (spessore di 250 nm).
3. Per disidratare il cromata substrato, lavare in isopropanolo e poi cuocere su una piastra calda per 5 minuti a 115 ° C.
4. Asciugare i substrati e primo con esametildisilazano (HMDS) di spin-coating (30 s, 3000 rpm). Spin-coat nuovo (utilizzando parametri identici) con Shipley S1811 photoresist.
5. Pre-cuocere il substrato su piastra riscaldante (100 ° C, 2 min), poi modello il photoresist da esposizione a raggi ultravioletti (UV) irradiazione per 5 s attraverso un fotomaschere.
6. Sviluppare l'UV-esposti substrati a Shipley MF 321 developer per 3 min e lavare in acqua deionizzata. Post-cuocere su una piastra a 100 ° C per 1 min.
7. Etch il cromo esposti immergendolo in cromo mordenzante per 30 secondi Sciacquare in acqua deionizzata, poi immergere in spogliarellista AZ300T per 10 minuti per rimuovere il photoresist rimanente. Sciacquare con acqua deionizzata e asciugare con N ₂ gas.
8. Deposito 2-5 micron parylene-C (un polimero isolante) da vapore chimico deposizione su un substrato di cuscinetto fantasia cromo. Deposito del 50 nm di Teflon AF (per rendere la superficie idrofoba) da spin-coating una soluzione (1% peso / peso in Fluorinert FC-40) a 2000 rpm per 60 s. Post-cuocere sulla piastra riscaldante (160 ° C, 10 min).
9. Per formare la piastra superiore, cappotto una non-fantasia di ossido di indio e stagno (ITO) substrati di vetro di 50 nm Teflon AF, come sopra.
10. Post-cuocere entrambi i substrati su un piatto caldo (160 ° C, 10 min).

Parte 2: Set-up del dispositivo e automazione

1. In digitale dispositivi microfluidici utilizzato in configurazione "due-plate", ¹ gocce sono posizionate tra un substrato di fondo (con elettrodi di fantasia) e un substrato superiore (con un solo contigui, elettrodo trasparente, di solito formato da ITO).
2. Per impostare il dispositivo, rimuovere rivestimenti polimerici dal pad di contatto di un substrato di fondo da raschiare delicatamente con un bisturi. Coppia esposta pad del substrato inferiore a 40-pin (Figura 1a).
3. Potere-su un computer con LabView (National Instruments, Austin, TX), una casa costruita casella di controllo (con una serie di relè ad alta tensione che sono controllati da segnali da un National Instruments DAQPad), un generatore di funzioni, e un amplificatore . Il computer / controllo casella facilita il controllo dell'utente su richiesta di 100 V _RMS / 18 kHz, i segnali al dispositivo tramite il 40-pin.
4. Montare il dispositivo posizionando due pezzi di nastro biadesivo (140 micron di spessore totale) ai margini del supporto inferiore e completo di scivoli nanostrutturata ITO (piastra superiore).
5. Per inizializzare il sistema di controllo, eseguire il programma di calibrazione LabView (scritto in-house) per calibrare il controllo di feedback.
6. Caricare il campione e reagenti nelle cisterne appropriato (vedere paragrafo 3, sotto) e racchiudono sotto il substrato superiore (teflonato lato rivolto verso il basso). Collegare il connettore di terra al supporto superiore.
7. Caricare il codice di attivazione in LabView (scritto in-house) ed eseguire il programma per avviare attuazione delle gocce.

Parte 3: preparazione dei campioni e reagenti

1. Preparare tampone di lavoro (WB): 100 mm TrisHCl (pH 7,8) e 0,08% Pluronic F127 w / v.
2. Sciogliere proteina (s) da analizzare nel campione di WB e pipetta nel serbatoio 1 (R-1) del dispositivo, come mostrato nella figura 1b.
3. Preparare precipitante, acido tricloroacetico al 20% (TCA) in acqua deionizzata, e pipettare in R-2.
4. Preparare il tampone di lavaggio, 70/30 Cloroformio / acetonitrile (ACN) e pipettare in R-4.
5. Preparare tampone resolubilizing, 100 bicarbonato di ammonio mM (pH 8,0) e 0,08% Pluronic F127 w / v, e la pipetta in R-5.
6. Sciogliere riducente, tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP), a 10 mm di WB e pipettare in R-6.
7. Sciogliere agente alchilante, Iodoacetamide (IAM), a 12 mm di WB e pipettare in R-7.
8. Sciogliere tripsina in WB ad una concentrazione pari a 1 / 5 della concentrazione del campione di proteine ​​totali (vedi 3.1, sopra) e pipettare in R-8.

Parte 4: elaborazione digitale del campione Microfluidic

1. La seguente procedura è attuata automaticamente per mezzo di codice scritto in LabView-casa. Il volume di gocce dispensato dai serbatoi è definita dalle dimensioni degli elettrodi (in questo caso, le gocce sono dispensati ~ 600nL).
2. Dispensare una goccia di proteine ​​contenenti campioni da R-1 e una goccia di precipitante da R-2 (Figura 2, fotogramma 1). Unire le due gocce e consentire la goccia combinati per incubare per 5 minuti, con la conseguente precipitazione di proteins sulla superficie (Figura 2, Cornici 2-3). Azionare il surnatante dalla proteina precipitata al serbatoio di rifiuti, R-3 (Figura 2, Frame 4).
3. Erogare tre gocce di tampone di lavaggio da R-4 e guidarli attraverso la proteina precipitata al serbatoio di rifiuti, R-3 (Figura 2, Frame 5).
4. Lasciare asciugare il precipitato, e dispensare una goccia di tampone resolubilizing da R-5 alla proteina. Lasciare che il buffer per incubare per 20 minuti fino a quando il precipitato si è sciolta (Figura 2, Frame 6).
5. Dispensare una goccia di riducente da R-6 e si fondono con la goccia del campione. Mescolare la goccia combinato azionando che in 6 elettrodi in uno schema circolare. Lasciare la goccia di incubare per 1 ora a temperatura ambiente in una camera umidificata (Figura 3, Cornici 1-2).
6. Dispensare una goccia di agenti alchilanti da R-7 e si fondono con la goccia del campione, seguita da miscelazione (come in 4.5). Lasciare la goccia di incubare per 15 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata, al riparo dalla luce (Figura 3, Cornici 2-3).
7. Dispensare una goccia di tripsina da R-8, e si fondono con la goccia del campione, seguita da miscelazione (come in 4.5). Lasciare la goccia di incubare per 3 ore a 37 ° C in una camera umidificata su una piastra riscaldante (Figura 3, Cornici 3-4).

Parte 5: Post-Processing preparazione dei campioni

1. Rimuovere il supporto superiore e la digestione reazione estinguere con l'aggiunta di 0.6 ml di acido trifluoroacetico 2,5% in acqua.
2. Purificare prodotto spento reazione utilizzando ZipTips C18 (Millipore, Billerica, MA) in base alle istruzioni del produttore.
3. Diluire purificata campione in acqua deionizzata per un volume finale di 100 mL.

Parte 6: Spettrometria di Massa

1. Valutare il campione elaborato su un nano-HPLC accoppiato ad uno spettrometro di massa tandem. Il sistema HPLC utilizzato qui è da Technologies Eksigent ed è dotato di una colonna trappola (3 mm di diametro. Perle di C18, 150 ID micron x 2,5 cm) e una fase inversa colonna di separazione (3 diametro di micron. Perle di C18, 75 micron x ID 15 cm). Lo spettrometro di massa qui è un LTQ di Thermo Fisher Scientific-.
2. Caricare un campione di 2 microlitri nella colonna trappola a 5μL/min in una fase mobile composta da 5% di acetonitrile in acqua. Separare il campione sulla colonna in fase inversa a 0.5μL/min utilizzando un gradiente lineare dal 20% acetonitrile acetonitrile al 80% per 25 min. Continua l'esecuzione a 80% acetonitrile per altri 10 min.
3. Analizzare le bande eluizione di fuori della colonna mediante spettrometria di massa tandem. Nel lavoro qui riportato, l'eluente viene campionato in spettrometro di massa tramite un emettitore nanoelectrospray (20 micron ID ID ridotto gradualmente a 10 micron) da NewObjective.
4. Identificare le proteine ​​nel campione utilizzando un programma di ricerca nel database come SEQUEST. In questo lavoro, abbiamo utilizzato la versione di SEQUEST incorporato nel Bioworks v3.01 (Thermo Fisher Scientific-), e le proteine ​​identificate probabilità avevano un punteggio inferiore a 1.0E-03 (pari al 99,9% intervallo di confidenza), e la sequenza delle coperture a almeno il 30% (Figura 4).

Figura 1. (A) Una foto di un dispositivo accoppiato DMF a 40-pin per l'attivazione automatica delle gocce. (B) Una schematica di un dispositivo che rappresenta il posizionamento del campione e reagenti necessari per un workup proteomica.

Cornici Figura 2. Da un film che rappresenta l'estrazione automatica e la purificazione di BSA nel 20% TCA (precipitante) e acetonitrile 70/30% cloroformio / (soluzione di risciacquo). Nel frame 6, la proteina è precipitata ridisciolto in una goccia di 100 mM di bicarbonato di ammonio.

Figura 3. Fotogrammi da un filmato che illustra riduzione sequenziale, alchilazione, e la digestione di una goccia di proteine ​​resolubilized. In questa figura, i reagenti sono colorati con coloranti per chiarezza, in pratica, i reagenti non sono colorati.

Figura 4. Cromatogramma MS di un campione di albumina sierica bovina trattati da microfluidica digitale. 25 peptidi distinti sono stati identificati (99,9% intervallo di confidenza) corrispondente sequenza una copertura del 44%.

Discussione

La mancanza di manipolazione del campione standardizzati e l'elaborazione di proteomica è una limitazione importante per il campo. Inoltre, convenzionali di gestione dei campioni macroscala coinvolge più contenitori e trasferimenti soluzione, che può portare a perdita di campione e la contaminazione. Una possibile soluzione a questi problemi è quello di formare sistemi integrati per l'elaborazione del campione affidamento su digitale microfluidica ¹ (DMF). Nel precedente lavoro, DMF ha dimostrato di e...