La capacità di cellule germinali embrionali di differenziarsi in cellule germinali primordiali durante le prime fasi di sviluppo è un modello perfetto per affrontare la nostra ipotesi sul cancro e la sterilità. Questo protocollo mostra come isolare le cellule germinali primordiali di gonadi in via di sviluppo 10,5-11,5 embrioni giorni post coitum mouse.
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Articolo metodologico
L'isolamento e la derivazione di cellule embrionali del mouse Germinal
In questo articolo
Sommario
Abstract
La capacità di cellule embrionali germinali (EG) a differenziarsi in cellule germinali primordiali (PGC) e più tardi in gameti durante le prime fasi di sviluppo è un modello perfetto per affrontare la nostra ipotesi sul cancro e la sterilità. Questo protocollo mostra come isolare le cellule germinali primordiali di gonadi in via di sviluppo 10,5-11,5 giorni post coitum (DPC), embrioni di topo. Lo sviluppo di creste delle gonadi da embrioni di topo (C57BL6J) erano dissociate dalla rottura meccanica con collagenasi, poi placcato in uno strato di fibroblasti di topo alimentatore embrione (MEF-CF1) che precedentemente era mitoticamente inattivati con mitomicina C in presenza di mezzi di comunicazione ad eliminazione diretta e integrata con Inibitore leucemia Factor (LIF), fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), e Stem Cell Factor (SCF). L'utilizzo di questi metodi di ottimizzazione per l'identificazione PCG, l'isolamento, e la creazione di condizioni di coltura permette di culture a lungo termine delle cellule EG per più di 40 giorni. Le linee sulle cellule germinali hanno mostrato fenotipo embrionale ed espressione di marcatori comuni usati dello stato pluripotente. L'isolamento e la derivazione di cellule germinali in coltura fornire uno strumento per comprendere il loro sviluppo in vitro e offrono la possibilità di monitorare i danni cumulativi a livelli genetici ed epigenetici dopo l'esposizione allo stress ossidativo.
Protocollo
Parte 1: Laparotomia mouse in gravidanza
- Utilizzando dislocazione cervicale, l'eutanasia un topo gravide C57BL6J femminile a 10,5-11,5 dpc.
- Pulire l'addome con sapone antimicrobico, e poi, radersi.
- Dopo la rasatura, lavare l'addome con una soluzione salina.
- Poi, a secco l'addome con una garza sterile.
- Coprire il mouse con un nuovo campo sterile.
- Effettuare una incisione ventrale con pinze e forbici dissezione.
- Identificare e rimuovere l'utero intero dalla cavità addominale. Embrioni di topo saranno visibili all'interno dell'utero.
- Trasferire l'utero in una scatola Petri riempite con D-PB....
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Dichiarazioni
Questa ricerca è stata condotta dopo la revisione e la cura degli animali istituzionali e Usa Committee (IACUC) l'approvazione del nostro protocollo del mouse # 08030 (Il ruolo della Reactive Oxygen Species, ROS in fase di sviluppo della linea germinale e la formazione del tumore: Holding e allevamento protocollo) a Mississippi State University.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare per la preziosa collaborazione di: Dott. Neal First e Kourtney Wilkinson per il manoscritto di editing; Dr. Lucy Senter, il Dr. Brigit Willeford e Mike Basett per l'assistenza con cura la formazione e animali presso la struttura del mouse ALAC MSU accreditati; Dr. Dwayne Wise per la sua assistenza con la microscopia e la cattura dell'immagine; Cesar Monroy, Hannah Swoope, e Bobbie Huddleston per la loro assistenza con la produzione video a MSU. Questa ricerca è stata finanziata dall'Ufficio di ricerca istituzionale e il Dipartimento di Scienze Biologiche presso Mississippi State University.
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Materiali
Pinze n. 14 e 15, bisturi 35 mm, forbici dissezione, campi chirurgici, sapone antisettico, soluzione salina 0,9%, garza, schiuma contenitore di ghiaccio, lama di rasoio, bisturi 35 mm, pinza sottile n ° 4 e 5, con ago sottile presa in giro con maniglia, filtro fogli di carta, e tirò pipette di vetro.
Equipaggiamento: stereomicroscopio da dissezione, sorgente luminosa Schott Fostec, microscopio invertito, micropipetta 10 e 200ul, centrifuga, cappa di sicurezza biologica.
Equipaggiamento: stereomicroscopio da dissezione, sorgente luminosa Schott Fostec, microscopio invertito, micropipetta 10 e 200ul, centrifuga, cappa di sicurezza biologica.
Riferimenti
- DeFelici, M. Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, Second Edition, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: ....
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Ristampe e permessi
