Qui vi mostriamo come fare retro-orbitale iniezione in zebrafish adulti.
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Articolo metodologico
Retro-orbitale iniezione in Zebrafish adulti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Trattamento farmacologico degli animali tutto è uno strumento essenziale in qualsiasi sistema modello per studi di genetica e chimica farmacologica. Per via endovenosa (ev) è spesso la forma più efficace e non invasiva di consegna di un agente di interesse. Nel pesce zebra (
Protocollo
Parte 1. Preparazione del materiale di iniezione
- Tg (globina: GFP) celle:
- Bleed pesce adulto donatore utilizzando punta della pipetta 10ul rivestito in eparina (1unit/ul) a pescare puntura dietro branchia.
- Aspirare globuli rossi e dispensare nel buffer di cella (0.9x PBS + 5% FBS + 1% Pen / Strep).
- Cellula sospensione filtro su mesh 40uM e determinare la concentrazione di cellule utilizzando emocitometro come precedentemente descritto da LeBlanc et al.
- Spin down e risospendere in buffer cella a concentrazione desiderata in modo tale che il volume di iniezione finale non è più di 5UL. Qui iniettare 1,5-2000000 cellule / destinatario.
- Per le, destrano Texas Red ®, sciogliere il colorante in DPBS per una concentrazione di iniezione finale di 10-12 mg / mL. Piano per iniettare 4 uL per pesce.
Parte 2. Iniezione
- Anestetizzare pesce in tricaine (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml pesci d'acqua).
- Lavare Hamilton siringa 3-4 volte prima dell'iniezione utilizzando etanolo al 70%. Lavare 3-4 volte con DPBS 0.9x.
- Luogo pesce lato dorsale e rivolta a destra sulla spugna umida.
- Tenere la siringa Hamilton con la mano destra e con il dito indice sullo stantuffo. Delicatamente stabilizzare il corpo del pesce con la mano sinistra.
- La posizione della lancetta con lo smusso rivolto verso l'alto in modo tale che se l'occhio del pesce s fosse un orologio, l'ago sarebbe indicando la posizione 7:00 e con un angolo di 45 gradi per il pesce (figura 1).
- Inserire delicatamente l'ago 1-2 mm in posizione 07:00 e lentamente spingere il pistone.
- Permettono di recuperare il pesce in acqua dolce E3.
- Lavare ago, come descritto sopra, tra le iniezioni di reagenti diversi.
- Flick soluzione cellula per risospendere le cellule ogni pochi minuti per evitare grumi di cellule.
- Mantenere il flusso di pesce per 1 settimana con cambi d'acqua ogni giorno per evitare l'infezione. Noi mantenere i pesci in acqua terapia intensiva per questo periodo (cappotto stress da 10 ml + 5 ml + pemafix melafix 5mL per 38 litri di acqua E3).
Parte 3. Rappresentante Risultati
Quando eseguito correttamente, è possibile visualizzare materiale iniettato se è stato etichettato in qualche modo. Per esempio, Tg (globina: GFP) globuli rossi dovrebbe essere visto sotto un microscopio a fluorescenza dissezione circola nei vasi dei pesci destinatario casper subito dopo l'iniezione, come illustrato in figura 2. Allo stesso modo, l'iniezione di un destrano 70kDa, coniugato con Texas Red ® possono essere visualizzati nel sistema vascolare del pesce trasparente immediatamente successivo retro-orbitale di iniezione (figura 3). Cellule renali fluorescenti da Tg (β-actina: GFP) pesci donatore può anche essere iniettato retro-orbitalmente in pesci irradiati destinatario casper. Queste cellule finalmente a casa per il midollo destinatario (figura 4a) e può quindi andare a ripopolare il rene dopo diverse settimane (figura 4b).
Se l'iniezione è troppo bassa o l'angolo dell'ago bypassa il retro-orbitale cavità dei seni venosi, materiale iniettato può essere visualizzata pooling intorno all'occhio o che scorre fuori di esso. In alternativa, se l'iniezione è troppo profondo, pesce possibile che si verifichino danni ai tessuti o sanguinamento eccessivo, anche se può ancora recuperare. Quando eseguito correttamente, la mortalità dopo retro-orbitale di iniezione deve essere inferiore al 5% del totale pesce iniettato e il successo di consegna alla circolazione sanguigna dovrebbe essere superiore al 90% del totale pesce iniettato.
Figura 1: Illustrazione di retro-orbitale tecnica di iniezione. L'occhio destro del pesce è rappresentato come un orologio analogico in cui l'orologio sette o posizione corrisponde al punto d'iniezione corretta.
Figura 2: Tg (globina: GFP) globuli rossi circolanti nei vasi della coda di un pesce adulto casper tre giorni dopo la retro-orbitale iniezione.
Figura 3: iniezione di successo di una 70kDa destrano coniugato con Texas Red ® usato come colorante fluorescente produce vascolarizzazione nei pesci adulti trasparente, Casper ed è facilmente visualizzati utilizzando standard di tutta la microscopia a fluorescenza animale.
Figura 4a: Tre giorni successivi retro-orbitale iniezione di cellule intere midollo rene da Tg (β-actina: GFP) pesci donatore, le cellule possono essere visualizzati homing al midollo reni del combustibile irraggiato pesce destinatario casper adulti.
Figura4b: Quattro settimane dopo la retro-orbitale iniezione di cellule intere midollo rene da Tg (β-actina: GFP) pesci donatore, il ripopolamento del rene destinatario con verde cellule renali di tutto midollo del donatore possono essere visualizzati in irradiati pesce destinatario casper adulti.
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Discussione
Retro-orbitale iniezione in zebrafish adulto offre la massima efficienza della consegna del materiale iniettato alla circolazione sanguigna con la più bassa incidenza di mortalità. A causa della natura del punto di iniezione, la puntura sembra guarire in fretta, diminuendo l'insorgenza di infezioni e la quantità di perdita di sangue. Il sito può anche essere iniettato ripetutamente nel corso di un breve periodo di tempo per iniezioni giornaliere di farmaci, per esempio.
Grandi quantità d...
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Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato da Howard Hughes Medical Institute e una borsa di studio del NIH per lo studio della ematopoiesi embrionale.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sale sodico di eparina da mucosa intestinale suina | Sigma-Aldrich | 2106 | Vial prepesato di 300 unità USP |
| Tricaine-S | Western Chemical | MS-222 | |
| Dulbecco’s Soluzione salina tamponata al fosfato | Invitrogen | 14190-144 | |
| Destrano, Texas Red® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5 mM NaCl 0,17 mM KCl 0,33 mM CaCl2 0,33 mM MgSO₄2 | ||
| Siringa microlitrica | Hamilton Co | 80300 | 701N 10 µL SYR (26s/2”/2) |
Riferimenti
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
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Ristampe e permessi
