Sinapsi glutammatergica possibile passare da una modalità attiva di una modalità silenziosa. Abbiamo dimostrato che lo stato presinaptica attività nella cultura dissociata dei neuroni di roditori viene visualizzato per mezzo una forma risolvibile del colorante-43 FM1 per visualizzare sinapsi attiva e immunostaining con vGluT-1 anticorpi per visualizzare tutte le sinapsi glutammato.
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Articolo metodologico
Sinapsi Presynaptically silenzioso studiato con microscopia ottica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Alla base di plasticità sinaptica probabilmente la capacità del sistema nervoso per imparare e ricordare, che potrebbero anche rappresentare un adattamento che impedisce in qualche modo danneggiare gli insulti di diventare neurotossici. Abbiamo studiato una forma di plasticità presinaptica che è interessante anche perché è espresso in commutazione digitale on e off della capacità di un terminale presinaptico s per rilasciare vescicole contenenti il neurotrasmettitore glutammato. Qui mostriamo un protocollo per visualizzare lo stato di attività dei terminali presinaptici in colture cellulari dissociato preparati con l'ippocampo roditori. Il metodo si basa sulla rilevazione sinapsi attiva utilizzando colorazione con una forma risolvibile del colorante styryl FM1-43, comunemente usato per etichettare vescicole sinaptiche. Questo profilo colorazione viene confrontato con immunocolorazione dei terminali stessi con un anticorpo diretto contro il trasportatore del glutammato vescicolare 1 (vGluT-1), una macchia progettato per etichettare tutti sinapsi glutammato indipendentemente dallo stato di attivazione. Troviamo che stimoli depolarizzanti indurre silenziamento presinaptica. La popolazione di sinapsi che tace in condizioni basali può essere attivato prolungato silenzio elettrico o attraverso l'attivazione di percorsi di cAMP segnalazione.
Protocollo
Cultura preparazione
- Preparare colture di cellule dissociate di cellule dell'ippocampo di ratto o topo dal primo giorno dopo la nascita 0-3 animali 1. I nostri neuroni aderiscono ad un monostrato di fondo astrociti, che a sua volta aderisce a un livello di collagene diffuso su un vetrino numero 0 spessore. Piastra i neuroni ad una densità di circa 500 cellule per centimetro quadrato.
- Lasciare le culture a crescere per 10-14 giorni per consentire lo sviluppo e la maturazione sinaptica. Trattare le culture in vitro al giorno 4 con il AraC antimitotici di arrestare l'ulteriore crescita gliali. Dar loro da mangiare al giorno in vit....
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Discussione
Significato
- Tipicamente le sinapsi sono pensati per operare attraverso il rilascio di trasmettitore con una probabilità misurabile. Lavoro da noi stessi e gli altri rende evidente che alcune sinapsi sono refrattari al rilascio di neurotrasmettitore, nonostante una serie completa di trasportatore vescicolare dei neurotrasmettitori e altri indicatori chiave presinaptico 2, 6-8. Abbiamo dimostrato in precedenza che l'attività di rete basale nei neuroni è essenziale per mantenere questa popolazione.......
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Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH DA018109 e MH78823, e NIH Neuroscienze Blueprint Nucleo di Grant P30NS057105 alla Washington University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| FM1-43FX | Invitrogen | F-35355 | È disponibile anche una versione con spostamento verso il rosso di FM4-64FX, ma si è rivelata meno adatta per saggi di silenziamento presinaptico. |
| Advasep-7 | CyDex | AR-0A7-001 | |
| vGluT-1 | EMD Millipore | AB5905 | |
| Anti-GP coniugata con Alexa 647 | Invitrogen | A-21450 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
Riferimenti
- Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Olney, J. W., Mennerick, S.
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Ristampe e permessi
