Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

Summary

Descriviamo un metodo per osservare la replicazione in tempo reale di singole molecole di DNA mediate da proteine ​​del sistema di replica batteriofago.

Abstract

Descriviamo un metodo per osservare la replicazione in tempo reale di singole molecole di DNA mediate da proteine ​​del sistema di replica batteriofago. Linearizzato λ DNA è modificato in modo da avere un biotina alla fine di un filo, e un residuo di digossigenina sull'altra estremità del filo stesso. La fine biotinilato è collegato a un coprioggetto di vetro funzionalizzati e la fine digoxigeninated ad una piccola biglia. L'assemblaggio di questi DNA-tallone attacchi sulla superficie di una cellula di flusso consente un flusso laminare da applicare a esercitare una forza di resistenza sul tallone. Di conseguenza, il DNA è allungata vicina e parallela alla superficie del vetrino con una forza che è determinata dalla velocità di flusso (Figura 1). La lunghezza del DNA viene misurata attraverso il monitoraggio della posizione del tallone. Differenze di lunghezza tra il DNA a singolo e doppio filamento sono utilizzati per ottenere informazioni in tempo reale l'attività delle proteine ​​replica al bivio. Misurare la posizione del tallone consente precisa determinazione dei tassi e processivities del DNA di svolgimento e di polimerizzazione (Figura 2).

Protocol

1. DNA replica Template

DNA per la reazione è un DNA λ linearizzato modificato dalla ricottura di oligonucleotidi per formare una forcella di replica. Inoltre, la biotina è fissata alla fine di un filamento del DNA λ, e un residuo di digossigenina è collegata all'altra estremità del filo stesso ^1.

Materiali: batteriofago λ DNA, Oligonucleotidi: braccio forcella biotinilato (A: 5'-biotina-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC-3 '), λ-complementare braccio a forcella (B: 5'-GGGCGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTCAG....

Discussion

E 'importante assicurare che la forza di trascinamento esercitata dal flusso laminare perle non influenza le attività enzimatiche delle proteine ​​di replica. Per esempio, un 3 pN forza che corrisponde ad una portata di 0,012 ml / min non influenza la replicazione del filamento di DNA di primo piano. Si pregiudica tuttavia l'attività enzimatiche che avvengono durante la sintesi del DNA coordinato, e deve quindi essere ridotta a 1,5 pN. La forza di trascinamento può essere facilmente controllato modificando la po.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Batteriofago λ DNA	New England Biolabs	N3011L
DNA Oligonucleotidi	Tecnologie
T4 DNA Ligasi	New England Biolabs	M0202L
T4 Polinucleotide chinasi	New England Biolabs	M0201L
&alfa;-digossigenina Fab	Roche Group	11214667001
Perline attivate da	tosilSeparatore magnetico Invitrogen	142-03
	Invitrogen	Dynal MPC
3-amminopropil-trietossisilano	Sigma-Aldrich	A3648	Altri aminosilani possono essere utilizzati o miscelati con silani reattivi non amminici per superfici più rade
PEG Succinimidil propionato	Nektar		PEG simili possono essere acquistati da Nanocs, CreativePEGWorks, ecc.
Biotina-PEG-NHS	Nektar		PEG simili possono essere acquistati da Nanocs, CreativePEGWorks, ecc.
Nastro biadesivo	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L	100 μ m spessore
Scivolo in quarzo	Vetro tecnico	20 mm (L)x 50 mm (L)x 1mm (A)	Dimensioni da inserire sui vetrini. Praticare fori con punte diamantate (DiamondBurs.net)
Tubi in polietilene	BD Biosciences	427416	0,76 mm ID, 1,22 OD È possibile sostituire tubi di altre dimensioni.
Streptavidin	Sigma-Aldrich	S4762	fare 1 mg/mL soluzione, 25 μ L aliquote in PBS pH 7.3
Miscela di soluzioni di desossiribonucleotide trifosfato	New England Biolabs	N0447
Microscopio ottico invertito con obiettivo 10X	Olympus Corporation Olympus	IX-51
Magnete permanente in terre rare	Importazioni nazionali	www.rare-earth-magnets.com
Fotocamera CCD	QImaging	Rolera-XR Fast 139
Pompa a siringa	Harvard Apparatus	11 Plus	Funziona in modalità di ricarica per facilitare i cambi di soluzione
Fiber Illuminator	Thorlabs Inc.	OSL1