Estrazione di proteine per l'analisi proteomica di specie fungine richiede alti livelli di standardizzazione da realizzare in accordo con le informazioni minime su un esperimento di proteomica (MIAPE) le linee guida. Vi presentiamo un video-protocollo che prevede una procedura di minimizzazione pregiudizi sperimentale durante l'induzione della tossina e l'estrazione di proteine da Fusarium spp.
Articolo metodologico
Tossina induzione ed estrazione di proteine da Fusarium Spp. Culture per studi di proteomica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Fusaria funghi filamentosi sono in grado di produrre tossine diverse. Micotossine del genere Fusarium, quali il deossinivalenolo, nivalenolo, T2, zearelenone, fusaric acido, moniliformina, ecc .. avere effetti nocivi sulla salute umana e animale e alcuni sono considerati come fattori di patogenicità. Studi di proteomica hanno mostrato di essere efficace per decifrare i meccanismi di produzione di tossine (Taylor et al., 2008) così come per identificare i fattori patogeni potenziali (Carta et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. Diventa quindi fondamentale stabilire metodi affidabili per il confronto tra gli studi di proteomica al fine di contare su vere differenze si trovano in espressione proteica tra esperimenti, ceppi e laboratori. La procedura che verrà descritta dovrebbe contribuire ad un aumento del livello di standardizzazione delle procedure di proteomica in due modi. Il protocollo girato è usato per aumentare il livello di dettagli che possono essere descritti con precisione. Inoltre, la disponibilità di procedure standardizzate di processo biologico replica dovrebbe garantire una robustezza maggiore di dati, tenendo conto anche del fattore umano all'interno della riproducibilità tecnica della procedura di estrazione.
Il protocollo descritto richiede 16 giorni per il suo completamento: quattordici giorni per le culture e due giorni per l'estrazione di proteine (figura 1).
In breve, i ceppi di Fusarium sono coltivate su terreni solidi per 4 giorni, sono poi manualmente frammentato e trasferito in un media tossina modificata indurre (Jiao et al, 2008.) Per 10 giorni. Micelio viene raccolto per filtrazione attraverso uno strato Miracloth. Rettifica è eseguita in una camera fredda. Diversi operatori effettuato l'estrazione repliche (n = 3) al fine di tener conto della distorsione dovuta a varianti tecniche (figura 2). L'estrazione è basata su un SDS / DTT tampone, come descritto nella Taylor et al. (2008) con lievi modifiche. Estrazione di proteine totali ha richiesto un processo di precipitazione delle proteine con Aceton / TCA / DTT lavaggio del buffer durante la notte e acetone / DTT (figura 3a, 3b). Proteine sono state finalmente resolubilized nella proteina di etichettatura buffer e quantificati. I risultati dell'estrazione sono stati visualizzati su un gel 1D (Figura 4, SDS-PAGE), prima di procedere alla 2D gel (IEF / SDS-PAGE). La stessa procedura può essere applicata per analisi proteomica su altri substrati di coltivazione e di altri funghi filamentosi (Miles et al., 2007).
Protocollo
Il protocollo richiede 16 giorni per il suo completamento. Il calendario dettagliato è in figura 1.
Dettagli per la preparazione del buffer
- Preparazione del tampone di lisi (3 ml per campione).
- Preparazione del tampone di lavaggio (50 mL per campione). Questo buffer deve essere pre-refrigerati e conservati a -20 ° C nel freezer fino a quando ulteriori analisi e tenuta in ghiaccio durante l'intera procedura.
- Preparazione del tampone precipitazioni (20 mL per campione). Questo buffer deve essere pre-refrigerati e conservati a -20 ° C nel freezer fino al momento e tenuta in ghiaccio durante l'intera procedura.
- Il lavoro dovrebbe preferibilmente essere effettuata nella camera fredda a 4 ° C.
Specie fungine
Tre ceppi utilizzati per le analisi proteomiche sono state classificate da Fusarium graminearum sulla base delle loro caratteristiche morfologiche e Traduzione-Allungamento Alfa-1 fattore di analisi (O'Donnell et al., 1998)
Questi ceppi appartenevano alla CRP-Gabriel Lippmann e la raccolta sono stati mantenuti e conservati a - 80 ° C in 15% glicerolo.
Preparazione di miceli
Funghi sono stati coltivati su V8 per 4 giorni a 25 ° C si alternano periodo di chiari e scuri ogni 12 ore. Le culture sono state frammentate con una lama sterile e pezzi di queste culture sono state utilizzate per inoculare beute da 250 ml contenente 100 ml di tossine che inducono i media. Miceli sono state raccolte dopo 10 giorni e sono stati separati dai media filtrando la cultura con un filtro sterile. Miceli sono stati lavati 3 volte con acqua sterile per rimuovere i residui di medie e di altri composti. Abbiamo quindi immediatamente congelato le cellule con l'aggiunta di azoto liquido e conservati i campioni a -80 ° C.
Descrizione generale di estrazione di proteine
Campioni di proteine sono stati estratti con il metodo descritto nella figura 3A e 3B. I campioni sono stati Fusarium terreno in azoto liquido e la polvere sono stati raccolti in 10 ml tubi in Teflon. I campioni sono stati poi incubati 30 minuti con il tampone di lisi, bollita per 10 minuti, 2 volte e centrifugati a temperatura ambiente (12000g per 15 minuti). I surnatanti sono stati raccolti e incubate a -20 ° C con buffer di precipitazioni durante la notte. Dopo centrifugazione a 4 ° C 30000g per 45 minuti, il pellet di proteine precipitate sono state lavate 3 volte con acetone freddo contenente DTT. Infine, i pellet sono stati essiccati e le proteine erano resolubilized nel buffer di etichettatura, la regolazione del pH a 8. Un sub-campione di 30 ml è stato rimosso per la quantificazione delle proteine totali e il surnatante rimanente è stato conservato a -20 ° C fino elettroforesi delle proteine.
Figura 1. Temporale della procedura.
Figura 2. Schema per operatori multipli campione di elaborazione.
Figura 3a. 
Figura 3b. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande figura 3a, oppure qui per una versione più grande di figura 3b.
Figure 3a-b diagrammi di flusso per la procedura di estrazione delle proteine (A: primo giorno; B: secondo giorno)..
Figura 4. 1D immagine di estratti proteici. Le proteine sono stati eseguiti fino migrazione completa del blu fino alla fine del gel che era macchiata di viola lava. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 4.
Discussione
Recente interesse per approcci di proteomica all'interno del dominio della biologia fungina ha portato ad un aumento del numero di pubblicazioni utilizzando questa tecnica (come recensione a Kim et al., 2007). Metodi per l'estrazione delle proteine si basano su una combinazione di procedure di estrazione, ma sono spesso scarsamente descritti nelle sezioni metodologiche e richiedono esperienza nel trattare con i metodi di risoluzione dei problemi potenziali.
Come per gli altri "omiche" si avvicina, definizione di standard per l'elaborazione dei campioni e dei dati è essenziale al fine di generare informazioni scientifiche affidabili. Inoltre i campioni e le procedure di manipolazione deve essere adeguatamente descritte in modo da consentire l'interpretazione risultato condiviso tra diversi "omiche" esperimenti. Questo sarebbe essenziale per sfruttare a pieno le potenzialità di cross-data mining nel campo della genomica, proteomica, metabolomica, ... (Morrison et al., 2006). Informazioni minime su un esperimento di proteomica è stato redatto e gruppi di lavoro sono stati creati al fine di affrontare tutti gli aspetti di un esperimento (gel elettroforesi, spettrometria di massa, le interazioni molecolari, modifiche delle proteine, Informatica Proteomica, Sample Processing). Al momento non sono disponibili informazioni definite sulle procedure di trattamento del campione. Data l'importanza delle procedure di estrazione delle proteine nel determinare la qualità finale di studi di proteomica, al fine di attuare procedure che possono aumentare di normalizzazione nel quadro di linee guida MIAPE (Taylor et al., 2007), abbiamo proposto l'uso di un protocollo video detailing sample elaborazione. Descrizione del video di esperimenti possono contribuire ad aumentare considerevolmente il numero di informazioni sul trattamento dei campioni che possono risultare in una migliore riproducibilità dei "omiche" esperimenti (Pasquali, 2007).
Infatti, la riproducibilità attraverso laboratori è un requisito fondamentale per garantire la validità dei risultati proteomica (http://www.fixingproteomics.org). Il cross-laboratorio riproducibilità è influenzata da due fattori: strumentazioni differenti e differenti operatori manipolare campioni.
Nel protocollo descritto, ci proponiamo di svolgere biologici replica che coinvolge più operatori (Figura 2 e video) di aumentare l'affidabilità dei dati (cioè variazione tecnica dei risultati viene preso in considerazione).
La procedura descritta per l'estrazione di proteine si basa sulla scheda di sicurezza e riscaldamento. Ciò è stato già dimostrato di garantire una buona purezza e la quantità di proteine (Ponte 1996). SDS accoppiato con bollente si scioglie pareti delle cellule, delle proteine idrofobiche e previene la formazione di oligomeri che le precipitazioni abortire delle proteine. Ebollizione consente anche l'inattivazione delle proteasi. Lo stesso effetto viene prodotto anche con EDTA, PMSF e completa inibitore della proteasi mini. DTT rimuove ponti disolfuro tra le proteine e facilitare la solubilizzazione delle proteine.
Al fine di rimuovere SDS prima IEF, le proteine vengono precipitate con l'acetone / TCA / DTT. Inoltre, acetone / TCA / DTT precipitazioni permette la rimozione di alcuni contaminanti come i lipidi, acidi nucleici, i sali e / o composti fenolici, quando questi composti sono presenti. Come la SDS, queste molecole prevenire una migrazione bene durante IEF. A seguito di questa precipitazione, è necessario lavare le proteine precipitate con l'acetone / DTT, in modo da eliminare TCA in quanto può interferire con IEF.
Una buona preparazione del campione è la chiave per un buon risultato. Per questo, è anche essenziale per evitare la contaminazione delle proteine dall'ambiente di lavoro con i guanti senza polvere e nel rispetto buone pratiche di laboratorio. Da un punto di vista tecnico, all'interno del protocollo descritto, le fasi più critiche di ottenere quantità sufficienti e la purezza delle proteine sono due fasi. In primo luogo, la fase di macinazione, dove completa distruzione delle cellule è fondamentale per liberare le proteine, e la seconda, la purificazione di proteine totali, una fase che comprende la rimozione della maggior parte dei lipidi, DNA e altri contaminanti che potrebbero interferire con la migrazione delle proteine.
Ringraziamenti
Ringraziamo Servane Contal e Boris Untereiner per il loro contributo tecnico. Riconosciamo l'appoggio di FNR progetto "FUTOX".
Materiali
Mezzi di comunicazione e soluzioni
PDA: 39 g di patate Destrosio Agar (Difco), 1 l di acqua distillata.
V8 agar: 200 ml V8 (Campbell, USA), 2g CaCO3 (Sigma), Agar 16g (Difco), 800 ml di acqua distillata
Tossine che inducono i media: 1g K 2 HPO 4, 0,5 g di KCl, 0,5 g MgSO 4 7H 2 O, 10 mg FeEDTA, 2g di L acido glutammico, saccarosio 10 g in 1 litro di acqua distillata.
Lysis buffer:
| 100 ml | Concentrazione finale | ||
| Tris-HCL pH8 | 5ml | 50mM | 1M |
| SDS | 2g o 10 ml | 2% | 20% |
| DTT | 500mL | 10mM | 2M |
| EDTA | 20 mL | 0.1mm | 0.5M |
| PMSF | 200 mL | ||
| Completa inibitore della proteasi mini | 1 compressa | ||
| Acqua | QSP |
Precipitazioni buffer:
| 100 ml | Concentrazione finale | |
| TCA | 20 mL | 20% |
| DTT | 0,1 ml | 0,1% |
| Aceton | QSP |
Tampone di lavaggio:
| 100 ml | Concentrazione finale | |
| DTT | 0,1 ml | 0,1% |
| Aceton | 100 ml |
Etichettatura Buffer (conservare a -18 ° C in piccole aliquote):
| 1 ml | Concentrazione finale | |
| Urea | 140 mg | 7M |
| Tiourea | 50 mg | 2M |
| CHAPS | 40 mg | 4% |
| Tris | 30 microlitri | 30 mM |
| Acqua | 1 ml |
Riferimenti
- Bridge, P. Protein Extraction from Fungi. Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).
- Jiao, F. Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture. FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).
- Kim, Y. Proteomics of filamentous fungi. Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).
- Milles, J. Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds. Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).
- Morrison, N., Field, D. Concept of sample in OMICS technology. OMICS. 10, 127-137 (2006).
- O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. PNAS. 95, 2044-2049 (1998).
- Paper, J. M. Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum. Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).
- Pasquali, M. Video in science. Protocol videos: the implications for research and society. EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).
- Taylor, C. F. The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE). Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).
- Taylor, R. D. Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions. Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).
Ristampe e permessi
