Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

Sommario

Questo protocollo descrive l'imaging di singoli neuroni o cellule della cresta neurale nel vivere embrioni di zebrafish. Questo metodo è utilizzato per esaminare i comportamenti e la localizzazione cellulare di actina mediante fluorescenza confocale microscopia time-lapse.

Abstract

Il pesce zebra è un modello ideale per i comportamenti delle cellule durante lo sviluppo di imaging in vivo. Embrioni di zebrafish sono fecondati esternamente e quindi facilmente accessibile in tutte le fasi di sviluppo. Inoltre, la loro chiarezza ottica permette l'imaging ad alta risoluzione del cellulare e dinamica molecolare in ambiente naturale dell'embrione intatto. Stiamo utilizzando un approccio dal vivo imaging per analizzare i comportamenti delle cellule durante la migrazione delle cellule neurali cresta e la conseguenza e la guida degli assoni neuronali.

Immagini dal vivo è particolarmente utile per comprendere i meccanismi che regolano i processi di motilità cellulare. Per visualizzare i dettagli della motilità cellulare, come l'attività protrusiva e dinamica molecolare, è vantaggioso per etichettare le singole celle. In zebrafish, iniezione di DNA plasmidico produce un transitorio pattern di espressione del mosaico e offre vantaggi distinti rispetto ad altri metodi di etichettatura delle cellule. Per esempio, linee transgeniche spesso etichetta popolazioni di cellule intere, e quindi possono oscurare la visualizzazione delle sporgenze fine (o cambiamenti nella distribuzione molecolare) in una singola cella. Inoltre, l'iniezione di DNA alla cellula uno stadio è meno invasiva e più precisa di iniezioni di colorante nelle fasi successive.

Qui si descrive un metodo per l'etichettatura di singoli neuroni di sviluppo o cellule della cresta neurale e di imaging il loro comportamento in vivo. Iniettiamo DNA plasmidico in 1 cellula-embrioni fase, che si traduce in espressione del transgene mosaico. I vettori contengono cellule specifiche per i promotori che l'espressione dell'unità di un gene di interesse in un sottogruppo di neuroni sensoriali o cellule della cresta neurale. Forniamo esempi di cellule marcate con GFP membrana mirati o con una sonda biosensore che consente la visualizzazione di F-actina in cellule viventi ^1.

Erica Andersen, Namrata Asuri, e Matteo Argilla contribuito in maniera uguale a questo lavoro.

Protocollo

1. Montaggio di diapositive di iniezione e diapositive di immagini

Iniezione di diapositive:

1. Preparare elastomero di silicone Sylgard secondo le istruzioni del produttore.
2. Utilizzare il Sylgard a legare tre microscopio vetro standard diapositive insieme da impilare una diapositiva in cima alla intersezione degli altri due diapositive, che sono disposti fianco a fianco ai bordi lunghi. La slitta superiore crea un angolo retto o "muro" tra la parte superiore e scivoli in basso.
3. Lasciate Sylgard set durante la notte. Queste diapositive sono riutilizzabili.

Imaging diapositiva:

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Discussione

La concentrazione ottimale di DNA iniettato può variare a seconda delle dimensioni e la forza del promotore costruire e devono essere determinati empiricamente. L'iniezione di DNA troppo può portare a embrioni non sani con la morte delle cellule esteso, mentre troppo poco si tradurrà in una piccola percentuale di embrioni iniettati esprimere il transgene. Il livello di espressione del DNA è correlata con la potenza del segnale fluoroforo, che varia da cellula a cellula. Mentre l'ordinamento degli embrioni sotto .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tricaina (etil 3-aminobenzoato metanosolfonato)	Sigma-Aldrich	A5040-250G
Kit per elastomero al silicone Sylgard	Dow Corning	184
QIAfilter Plasmid Midi Kit	Qiagen	12243
Agarosio a basso punto di fusione	Invitrogen	15517-014
Picospritzer	Parker Hannifin Corporation	051-0302-900