In questo video, dimostriamo la procedura di CD40-attivazione e l'espansione delle cellule B da splenociti murini di C57BL / 6 topi, che può essere utilizzato come modello di una cellula presentanti l'antigene (APC) per studiare l'induzione di immunità.
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Articolo metodologico
Modello murino di CD40-attivazione delle cellule B
In questo articolo
Sommario
Abstract
La ricerca sulle cellule B CD40 ha dimostrato che l'attivazione di migliorare la loro capacità di presentazione dell'antigene. Se stimolati con interleuchina-4 e CD40 ligando (CD40L), le cellule B umane può essere ampliato senza difficoltà da piccole quantità di sangue periferico entro 14 giorni di tempo per grandi quantità di altamente puri-CD40 delle cellule B (> 10
Protocollo
Il protocollo per la generazione di murino CD40 delle cellule B attivate (mCD40B) da splenociti è diviso in due parti: la parte A dimostra la preparazione di murino CD40 ligando (CD40L) che esprime cellule HeLa (tmuCD40L HeLa), che sarà usato come piastra legato cellule nutrici. Parte B descrive l'attuale murino B CD40-cultura.
A. Preparazione di cellule di alimentazione (tmuCD40L HeLa)
Il HeLa tmuCD40L è un aderente linea di cellule epiteliali umane, che non dovrebbe mai diventare completamente confluenti. Le cellule sono quindi suddivisi due volte alla settimana. Coltura per più di 6 settimane non è raccomanda....
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Discussione
Le modifiche di questo protocollo sono possibili, soprattutto per quanto riguarda l'origine di CD40-stimolo e il tipo di ceppo di topi utilizzati, anche cedendo nella generazione efficiente di murini CD40 delle cellule B attivate. Ahmadi et al. hanno mostrato risultati simili per i fibroblasti di topo murine transfettate con CD40-ligando. In questa presentazione contesto di xeno-antigene può essere esclusa con certezza, ma studi approfonditi in materia di sicurezza e tossicità in vivo non ha dato segni di r.......
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Dichiarazioni
Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida nazionali ed europee per il mantenimento degli animali da laboratorio. Riferendosi alla legge tedesca sul benessere degli animali gli animali erano controllati regolarmente dalle autorità competenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott. Clemens Wendtner per fornire tmuCD40-Ligand-HeLa linea cellulare.
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Materiali
A. Preparazione dei supporti:
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alimentatore cellule wild type media | Alimentatore cellulare medio selezione | ||
| Reagente | Concentrazione | Reagente | Concentrazione |
| RPMI 1640 | RPMI 1640 | ||
| L-Glutammina | 300 mg / ml | L-Glutammina | 300 mg / ml |
| FBS | 10% | FBS | 10% |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamicina | 15 mg / ml | Gentamicina | 15 mg / ml |
| Hygromycin B | 0,2 mg / ml |
| mCD40-B lavaggio medio | mCD40-B terreno di coltura | ||
|---|---|---|---|
| Reagente | Concentrazione | Reagente | Concentrazione |
| D-MEM | D-MEM | ||
| L-Glutammina | 580 mg / ml | L-Glutammina | 580 mg / ml |
| Glucosio | 4,5 mg / ml | Glucosio | 4,5 mg / ml |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamicina | 15 mg / ml | Gentamicina | 15 mg / ml |
| MEM | 0.1mm (1x) | ||
| FBS | 10% |
B. Varie Reagenti:
| Reagente | Azienda | Il decreto n. |
| RPMI 1640 | Invitrogen Gibco | REF 21875 |
| D-MEM | Invitrogen Gibco | REF 41965 |
| Dulbeccos PBS (10x) | PAA | Nessun gatto H15-011 |
| Gencin | Delta Select | Art. n. 7395800 |
| FBS | LONZA | Nessun gatto DE14-802C |
| HEPES Buffer | PAA | Nessun gatto S11-001 |
| MEM NEAA | Invitrogen Gibco | REF 11140 |
| Hygromycin B | PAA | Nessun gatto P02-015 |
| Ricombinante murino interleuchina-4 | Immunotools | Nessun gatto 12340045 |
| Ciclosporina A | Novartis | Nessun gatto NDC 0078-0109-01 |
| Tripsina / EDTA (10x) | Invitrogen Gibco | REF 15400-054 |
C. Varie Forniture:
| Reagente | Azienda | Il decreto n. |
|---|---|---|
| Puntali sterili | Sarstedt | |
| 6 pozzetti | NUNC | Nessun gatto 140675 |
| 50mL tubo conico | BD Falcon ™ | Nessun gatto 352070 |
| Tessuto cultura fiasco | Sarstedt | Nessun gatto 83.1813.002 |
Riferimenti
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M.
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Ristampe e permessi
