Imaging mismatch repair e risposte cellulari al danno del DNA in Bacillus subtilis</em

Sommario

Un protocollo dettagliato è descritto per l'imaging in tempo reale la formazione di complessi di riparazione del DNA in Bacillus subtilis Cellule.

Abstract

Sia procarioti ed eucarioti rispondere a danni al DNA attraverso una complessa serie di cambiamenti fisiologici. Alterazioni nell'espressione genica, la redistribuzione delle proteine ​​esistenti e l'assemblaggio di complessi proteici nuovo può essere stimolata da una varietà di lesioni del DNA e non corrispondenti coppie di basi del DNA. Microscopia a fluorescenza è stato utilizzato come un potente strumento sperimentale per visualizzare e quantificare le risposte a queste ed altre lesioni del DNA e per monitorare lo stato replicazione del DNA all'interno della complessa architettura subcellulare di una cellula vivente. Fusioni traduzionali tra proteine ​​fluorescenti giornalista e componenti della replicazione del DNA e riparazione macchinari sono stati utilizzati per determinare i segnali che l'obiettivo del DNA proteine ​​di riparazione delle lesioni ai loro affini

Protocollo

Colture di cellule in crescita per microscopia

1. Uno o due giorni prima di imaging, preparare la B. subtilis ceppo contenente la proteina di fusione traslazionale che si desidera visualizzare. Turni di prova di 1A e 1B passi saranno necessari per determinare quale condizione di crescita fornisce le migliori immagini del vostro sforzo. Nella maggior parte dei casi, le cellule dovrebbero essere esposte durante la fase di crescita esponenziale.

1. Per alcune B. ceppi subtilis (in particolare, i ceppi che crescono poco, grazie all'integrazione della fusione traslazionale tra il gene di intere....

Discussione

Tentativi ed errori sono necessari per trovare condizioni di esposizione per immagini di altissima qualità per ogni ceppo, troviamo che 1 millisecondo è appropriato per le immagini a luce bianca, mentre l'esposizione da 100 a 2000 ms sono appropriati per GFP (FITC) e FM4-64 (TRITC ) le immagini. Tempo di esposizione variano a seconda delle apparecchiature di imaging utilizzate. Si consiglia l'uso di un ceppo per 15 pozzetti vetrino da microscopio per il più semplice di imaging, come la qualità pad e la diffusion.......

Materiali

Ricette soluzione specifica ^1:

S7 10x ₅₀ sali
0,5 M MOPS
100 mM di solfato di ammonio
50 mM di potassio fosfato monobasico
Filtro sterilizzare, e avvolgere S7 ₅₀ supporti in fogli prima di stoccaggio

Metalli 100x
0,2 M MgCl ₂
70 mM CaCl ₂
5 mM MnCl ₂
0.1 mM ZnCl ₂
100 mg / ml tiamina HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl ₃ *
dH ₂ O a volume finale
* FeCl ₃ deve essere aggiunto all'ultimo, per evitare la precipitazione.
Dopo la sterilizzazione del filtro, avvolgere 100x soluzione in un foglio di metallo.

S7 ₅₀ mezzi
1x S7 ₅₀ sali
1x metallo
1% di glucosio
0,1% glutammato
40 mcg / mL triptofano
40 mcg / mL Fenilalanina
H ₂ O distillata a volume finale

Spizizens 10x (grammi / L)
151,4 solfato di ammonio mM (20 g / L)
803,8 mM di potassio fosfato monobasico (140 g / L)
440,9 mM di potassio fosfato bibasico (60g / L)
34,0 mM citrato di sodio (10 g / L)
16,6 mM MgSO ₄ (2g / L)
dH ₂ O a volume finale
Filtro sterilizzare