Decifrare Percorsi assonale di gruppi geneticamente definito di neuroni nel tubo neurale Chick Utilizzando In ovo Elettroporazione

Summary

Questo video viene illustrato come visualizzare i percorsi assonale di gruppi geneticamente definita di neuroni nel midollo spinale embrionale pulcino utilizzando In ovo di geni reporter sotto il controllo di specifici elementi enhancer.

Abstract

Impiego di elementi enhancer di guidare l'espressione di geni reporter nei neuroni è un paradigma ampiamente utilizzato per il monitoraggio proiezione assonale. Per il monitoraggio proiezione assonale degli interneuroni spinali nei vertebrati, della linea germinale mirati geni reporter indicazione del tenore simmetria bilaterale. Pertanto, è difficile distinguere tra il ipsi-e contro-lateralmente assoni proiezione. Elettroporazione unilaterale nel tubo neurale pulcino fornisce un mezzo utile per limitare l'espressione di un gene reporter per una parte del sistema nervoso centrale, ed a seguire proiezione assonale su entrambi i lati

Protocol

I. Elettroporazione

Uovo di movimentazione

1. Mettere le uova in un set umidificata incubatore a 37-38 ° C, preferibile un incubatore con vassoi a dondolo.
2. Embrione sono elettroporate dopo circa 66 ore di incubazione, quando hanno raggiunto Hamburger & Hamilton (HH) stadio 18-20. In questa fase la testa si trova ad angolo retto rispetto al tronco (condizione chiamata cervicale flessione) e una vasta serie di extra-embrionali vasi sanguigni, come anteriore, posteriore, destro e sinistro vene vitellina dovrebbe essere visto. Questa è una fase ottimale per enhancer-dipendente specifica espressione ^1,3,4. E 'importante monitorare temperatura e umidità dell'incubatore, al fine di ottenere embrioni vitali e sincronizzati.
3. Dopo 66 ore di incubazione, togliere le uova dal termostato. Mettere le uova in orizzontale. Attendere 5-10 minuti. L'embrione ora si trova al polo superiore dell'uovo.

Preparativi

1. Preparare la soluzione di Hank con penicillina / streptomicina (P / S) (diluizione 1:100).
2. Tirare in vetro capillari (0,5 mm di diametro) a microcapillare.
3. Posizionare gli elettrodi (tungsteno) in micromanipolatore e collegare gli elettrodi al generatore di impulsi (ECM 830).
4. Regolare il generatore di impulsi con i seguenti parametri: 30v tensione, numero di impulsi - 3, lunghezza dell'impulso di 50 ms.
5. Preparare una pipetta a bocca, un ago della siringa e di un nastro.
6. Preparare una miscela desiderata di DNA (2-5μg/μl) e aggiungere un colorante Fast Green.

Finestre ed elettroporazione

1. Utilizzando una siringa, togliere 5-6 ml di albumina da ogni uovo.
2. Con una piccola forbice aperta una finestra ovale sul lato superiore dell'uovo.
3. Umida l'embrione con 0,5-1ml di Hank + P / S soluzione.
4. Utilizzare una pipetta a bocca, per caricare il vetro microcapillare con la miscela di DNA.
5. Posto l'embrione con la coda verso di voi. In questa fase, il midollo spinale degli embrioni è chiaramente visibile. Pertanto, non sono richieste tecniche di contrasto. Il midollo spinale è sigillato alle due estremità, la testa e la coda, ma se il tuo microcapillare è abbastanza sottile, si sarà in grado di perforare un piccolo buco e penetrare il tubo neurale con un angolo basso. Un microcapillare di diametro diritto devono essere caricati facilmente con il DNA, penetrare il tubo senza danneggiarlo e rilasciare il DNA con una espirazione normale.
6. Iniettare il DNA usando una pipetta a bocca. Il colorante verde dovrebbe diffondersi dalla punta della coda fino alle vescicole di sviluppo del cervello.
7. Posizionare gli elettrodi in parallelo al tubo neurale, il più vicino possibile, senza toccare il tubo stesso e impulsi. Al momento dell'impulso, gli elettrodi devono essere coperti con il liquido per consentire la conducibilità elettrica. Di solito, la quantità di Hank aggiunto a chiedere l'elemosina è sufficiente. Se non aggiungere una goccia di Hank appena prima del polso.
8. Rimuovere con attenzione gli elettrodi e sigillare la finestra con un nastro. E 'importante per sigillare l'uovo interamente contro l'essiccamento della dell'embrione durante il periodo di incubazione successivo.
9. Posizionare la parte posteriore uova nell'incubatrice.

II. Midollo spinale libro aperto preparazione

Distacco del midollo spinale dall'embrione

1. Rimuovere l'embrione eletroporated, a E6, da l'uovo e metterlo in una capsula di Petri rivestito con silicone contenente PBS.
2. Tagliare le membrane e allungare l'embrione dalla sua parte ventrale mediante perni per tenerlo.
3. Utilizzando un tungsteno nitide microcapillare fare una incisione longitudinale lungo la lamiera del tetto, dal romboencefalo fino alla coda.
4. Fare un ulteriore due incisioni longitudinali su entrambi i lati del midollo spinale, staccando i gangli della radice dorsale (DRG) dal midollo spinale.
5. Staccare la piastra dal tessuto partendo dalla coda al romboencefalo, lasciando intatto il midollo spinale.
6. Tagliare il midollo spinale in una sezione trasversale al romboencefalo con le forbici fine e separato dal corpo.

Fissazione

1. Stendere il midollo spinale isolato in un nuovo piatto di Petri rivestito con silicone contenente PBS, con perni di tenerlo, dal romboencefalo alla coda produrre un piano di montaggio preparazione.
2. Versare il PBS dal piatto e sostituirlo con 4% paraformaldeide in PBS.
3. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.

Immunoistochimica

1. Trasferire il midollo spinale fisso in una fiala contenente l'anticorpo primario in PBS.
2. Incubare con agitazioni delicato per tutta la notte a 4 ° C.
3. Lavare l'anticorpo X5 volte con PBS, ogni lavaggio per 1 ora con agitazioni gentile.
4. Aggiungi anticorpo secondario e incubare con agitazioni delicato per tutta la notte a 4 ° C.
5. Lavare l'anticorpo X5 volte con PBS, ognilavaggio per 1 ora con agitazioni gentile.

Montaggio libro aperto per l'imaging

1. Macchia di grasso o silicone a forma di rettangolo su un vetrino e flebo PBS all'interno.
2. Posizionare il midollo spinale allungato al centro del rettangolo utilizzando una pinzetta e tirare fuori il liquido attorno ad esso con una pipetta Pasteur.
3. Luogo 1-2 gocce di mezzo di montaggio sul midollo spinale e coprire con coprioggetto. Squash per evitare bolle d'aria.
4. Tenere le diapositive buio a 4 ° C.
5. Ispezionare il midollo spinale usando la microscopia confocale.

Discussion

Elettroporazione di DNA plasmidico in embrione di pollo si evolve come una tecnica potente per in vivo espressione ectopica. La combinazione di stimolatori specifici, ed elettroporazione pulcino fornisce uno strumento rapido ed efficace per decifrare le vie assonale di un gruppo di neuroni geneticamente definito ^1,3,5. Utilizzando la Cre / loxP ed i sistemi di amplificazione Gal4/UAS può aumentare i livelli e la durata di espressione. Il quadro che emerge è di una divergenza complesso di spunti assonale che n...