La cellula permeabile reticolante DSP [dithiobis-(succinimidile propionato)] stabilizza le interazioni transienti e labile In vivo, Che consente loro isolamento utilizzando rigorosi tecniche di purificazione di proteine complesse. Qui vi presentiamo una tecnica per la reticolazione cellule in coltura seguita da isolamento di complessi proteici da immunoprecipitazione.
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Articolo metodologico
Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità
In questo articolo
Sommario
Abstract
La natura dinamica di macchine cellulare è spesso costruito sulle associazioni di proteine transitori e / o debole. Queste interazioni bassa affinità preclude metodi rigorosi per l'isolamento e l'identificazione di reti di proteine intorno ad una proteina di interesse. L'uso di reticolanti chimici permette la stabilizzazione selettiva delle interazioni labili, aggirando così le limitazioni biochimiche per la purificazione. Qui vi presentiamo un protocollo suscettibile di cellule in coltura che utilizza un reticolante homobifunctional con un braccio distanziatore di 12 Å, dithiobis-(succinimidile propionato) (DSP). DSP è scissa dalla riduzione di un legame disolfuro presenti nella molecola. Cross-linking in combinazione con la cromatografia di immunoaffinità di proteine di interesse con perline magnetiche permette l'isolamento di complessi proteici che altrimenti non avrebbe resistere purificazione. Questo protocollo è compatibile con le normali tecniche di Western Blot e può essere scalata per l'identificazione delle proteine mediante spettrometria di massa 1.
Stephanie A. Zlatic e Pearl V. Ryder contribuito in maniera uguale a questo lavoro.
Protocollo
1. Preparazione per reticolazione
- Avrete bisogno di piatto un numero sufficiente di celle per consentire l'isolamento di 500 mg di proteine per reazione tubo standard. Un tubo singolo può essere sufficiente per l'identificazione di putativi interattori di una proteina di interesse da immunoblot. In questo caso tallone materiale legato può essere eluito con SDS-PAGE tampone del campione (immunoprecipitazione). Per l'analisi di spettrometria di massa, il numero di reazioni standard dovrebbe essere aumentata almeno dieci volte e complessi di proteine deve essere eluita da fuori concorso con un antigene peptide riconosciuto dal anticorpo utilizzato (immuno....
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Discussione
DSP, una membrana permeabile, reticolante chimicamente riducibili con un braccio distanziatore di 12 A viene utilizzato per stabilizzare le interazioni proteina transitoria 1,2,3,4. Qui abbiamo esemplificato questa strategia con il complesso adattatore AP-3 un complesso proteina solubile che riconosce e ordina proteine di membrana in vescicole da endosomi 5. AP-3 si lega selettivamente al trasportatore di zinco ZnT3 e la chinasi dei lipidi fosfatidilinositolo-4-chinasi di tipo II, ma non dei rece.......
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Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health a VF (NS42599 e GM077569).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione salina tamponata al fosfato | Invitrogen | P4417 | Sciogliere 1 compressa in 200 mL di acqua; aggiungere MgCl2 fino a una concentrazione finale di 1 mM e CaCl2 fino a una concentrazione finale di 0,1 mM |
| Ditiobis(succinimidil propionato) (DSP) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22585 | Sensibile all'umidità, conservare in un contenitore ermetico a 4°C |
| Dimetilsolfossido (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Dynabeads, anticorpo anti-topo IgG di pecora | Invitrogen | 110.31 | Le perline sono disponibili anche come anticorpo anti-coniglio di pecora |
| Magnete Dyna-Mag-2 | Invitrogen | 123-21D |
Riferimenti
- Salazar, G. Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells. J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G.
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Ristampe e permessi
