Etichettatura fluorescente di COS-7 Esprimendo SNAP-tag proteine ​​di fusione per l'imaging cellulare dal vivo

Sommario

SNAP-tag e CLIP-tag sistemi di etichettatura attivare la proteina specifica, attacco covalente di molecole, tra cui coloranti fluorescenti, ad una proteina di interesse in cellule vive. Una volta clonato ed espresso, la proteina tag può essere utilizzato con una varietà di supporti per numerose applicazioni a valle senza dover clonare di nuovo.

Abstract

SNAP-tag e CLIP-tag sistemi di etichettatura attivare la proteina specifica, attacco covalente di molecole, tra cui coloranti fluorescenti, ad una proteina di interesse in cellule vive. Questi sistemi offrono una vasta gamma di substrati fluorescenti ottimizzato per una vasta gamma di strumenti di imaging. Una volta clonato ed espresso, la proteina tag può essere utilizzato con una varietà di supporti per numerose applicazioni a valle senza dover clonare di nuovo. Ci sono due passi a utilizzare questo sistema: la clonazione e l'espressione della proteina di interesse come SNAP-tag di fusione, e l'etichettatura della fusione con la SNAP-tag substrato di scelta. Lo SNAP-tag è una piccola proteina umana sulla base di O

Protocollo

Placcatura cellule CHO-K1:

1. Aggiungi 50-100μl di cellule CHO-K1 che sono stati trypsinized secondo protocolli standard a 6 ml di completo F-12K.
2. Mescolare sospensione cellulare pipettando su e giù parecchie volte, poi aliquota 300 ml di sospensione cellulare trypsinized a ciascun pozzetto di una camera sterile 8-Lab-Tek II Chambered vetrino con # 1.5 borosilicato coprioggetti camere (Nalgene Int. Nunc;. Prodotto # 155409; Lotto: 100808-8-0).
3. Incubare i campioni a 37 ° C, 5% di CO ₂ durante la notte.

Trasfezione transiente di cellule CHO-K1 con pSNAP-ADRB2 e pSNAP-H2B:

1. Controllare le camere di coltura cellulare seminato il giorno precedente a cercare la densità delle cellule e la salute.
2. Etichettare il numero adeguato di appositi tubi microcentrifuga.
3. In una cappa a flusso laminare, istituito miscele complesse di trasfezione in base alla tabella di esempio, utilizzando 0,3 mcg pSNAP-ADBR2 DNA plasmidi di controllo o di 0,3 mcg di pSNAP-H2B DNA di controllo plasmidi, 1 l di D2 TransPass e 1 ml di TransPass V per reazione.

   plasmide	numero di reazioni	ml di mezzo privo di siero	l di D2 TransPass	l di TransPass V	l di DNA plasmidico	l di D2/reaction TransPass	l di TransPass V / reazione	ng di DNA / reazione	DNA conc. (Ng / mL)	l di DNA plasmidico / reazione
   SNAP-ADRb2	5	236,5	5	5	3,5	1	1	300	472,34	0,7
   H2B-SNAP	5	237	5	5	3	1	1	300	515,89	0,6
   Finto	5	240	5	5	0	1	1	0	0	0
   Untransfected	5	250	0	0	0	0	0	0	0	0

4. In primo luogo, mescolare il siero libero F-12K con il DNA plasmidico appropriata, quindi aggiungere il D2 Transfection Reagent TransPass, quindi aggiungere il Transfection TransPass V reagente. Miscelare i componenti ben pipettando su e giù delicatamente più volte dopo l'aggiunta di ogni reagente.
5. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 30 minuti.
6. Durante l'incubazione, lavare le cellule una volta con 600 ml di DMEM completo ed aggiungere 450 ml di DMEM completo di ogni campione.
7. Aggiungere 50 ml di miscela di trasfezione complesso per ogni campione, lentamente e in una goccia a goccia moda.
8. Incubare i campioni durante la notte a 37 ° C, 5% di CO _2.

SNAP-Cell Stella Etichettatura TMR di CHO-K1 cellule trasfettate transitoriamente con pSNAP-ADRB2 e pSNAP-H2B:

1. Rimuovere con attenzione i media trasfezione complesso da ciascun campione di aspirazione. Lavare le cellule due volte con 600 ml di completo F-12K e sostituire il supporto in ogni pozzetto con 600 ml di completo F-12K.
2. Media mix etichettatura tintura con l'aggiunta di 995 ml di completo F-12K e 51 microlitri 0,6 mm SNAP-Cell TMR-Star substrato. La concentrazione finale di SNAP-Cell TMR-Star dovrebbe essere 3 mm. Pipetta su e giù parecchie volte per mescolare dopo l'aggiunta del substrato.
3. Rimuovere con attenzione la crescita dei media da campioni e aggiungere 200 ml di etichettatura dei media colorante in ciascun pozzetto. Incubare i campioni a 37 ° C, 5% di CO ₂ per 30 minuti.
4. Mentre i campioni sono incubazione preparare Hoechst 33342 soluzione per la colorazione nucleare dei campioni mescolando 1 ml di Hoechst 33342, trihydrochloride, triidrato (10 mg / ml di soluzione in acqua, soluzione 16,2 mM; Probes Invitrogen Molecolare) in 10 ml di completo F-12K .
5. Rimuovere il supporto da tutti i campioni e aggiungere 600 microlitri della soluzione diluita Hoechst per ogni campione. Incubare i campioni a 37 ° C, 5% di CO ₂ per 5 minuti.
6. Lavare i campioni per tre volte con 600 ml di completo F-12K.
7. Incubare i campioni a 37 ° C, 5% di CO ₂ per ulteriori 30 minuti per permettere fluoroforo prive di personalità giuridica di diffondere fuori delle cellule.
8. Dopo 30 minuti, cambiare i mezzi di comunicazione sul SNAP-Cell campioni un'ultima volta e procedere con l'imaging.
9. Immagine le cellule utilizzando un Apotome Zeiss Axiovert 200M microscopio a fluorescenza.

Rappresentante Risultati

Figura 1. Qui ci sonoalcuni risultati rappresentativi di imaging a fluorescenza con un microscopio a fluorescenza di vivere cellule COS-7 che esprimono SNAP-tag fusioni. Questa prima immagine mostra dal vivo COS-7 cellule che esprimono pSNAP-H2B (nucleare istoni) marcato con SNAP-Cell TMR-Star. Il pSNAP-H2B costruzione è stata generata utilizzando le pSNAP-tag (m) vettoriale. Le cellule sono state etichettate con SNAP-Cell TMR-Star per 30 minuti e di contrasto con Hoechst 33342 (blu) per i nuclei. La fluorescenza rosa dimostra la sovrapposizione di fluorescenza rossa dove proteina istone è presente oltre alla fluorescenza blu che indica il nucleo. L'espressione della proteina H2B è chiaramente e facilmente identificabile.

Figure 2 e 3. Le prossime due immagini mostrano dal vivo cellule COS-7 transfettate con transitoriamente pSNAP-ADRβ2.
Le cellule sono state etichettate con SNAP-Cell TMR-Star (rosso) e di contrasto con Hoechst 33342 (blu). Il pSNAP-ADRβ2 costruzione è stata generata utilizzando le pSNAP-tag (m) vettoriale. Le cellule sono state etichettate con SNAP-Cell TMR-Star per 30 minuti e di contrasto con Hoechst 33342 (blu) per i nuclei. La fluorescenza rossa indica la presenza di ADRB2 recettore sulla superficie cellulare di proteine, mentre la fluorescenza blu identifica il nucleo.

Discussione

Ci sono diverse variabili influenzano i risultati osservati, come messa a fuoco, l'intensità del laser, capacità delle apparecchiature, obiettivo utilizzato, ecc fotostabilità del fluoroforo determina la velocità di fluorescenza deve essere catturato prima di svanire.

Questo metodo di etichettatura delle proteine ​​è versatile e adatto per molte applicazioni. Tecnologie SNAP-tag e CLIP-tag per l'etichettatura specifica di proteine ​​di fusione con sonde sintetiche consentono vari aspetti della funzione della proteina, tra cui una varietà di processi dinamici in cellule vive e in lisati cellulari. SNAP-,-CLIP, MCP-e ACP-tag tecnologie offrono versatilità e semplicità straordinaria per l'imaging di proteine ​​in cellule vive e fissi e allo studio delle proteine ​​in vitro. La creazione di un costrutto singolo gene produce una proteina di fusione con tag in grado di formare un legame covalente a una varietà di gruppi funzionali, tra cui fluorofori, biotina, o perline. La proteina di interesse deve essere clonato ed espresso una sola volta e poi la fusione può essere utilizzata con una varietà di substrati fluorescenti per numerose applicazioni a valle come l'etichettatura proteina simultanea all'interno delle cellule vive, la localizzazione delle proteine ​​e la traslocazione, pulse-chase esperimenti, studi di internalizzazione del recettore , selettivo etichettatura superficie cellulare, la proteina abbattere analisi, la rilevazione delle proteine ​​in SDS-PAGE, citometria a flusso, analisi di legame high-throughput in micropiastre, esperimenti di interazione biosensore, e saggi di binding FRET-based.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cellule CHO-K1	ATCC	CCL-61
F-12K senza siero
Lab-Tek II Chambered Coverglass con camere in vetro borosilicato #1.5	Nalge Nunc international	155409	Lotto: 100808-8-0
DMEM
H–chst 33342, triidrocloruro, triidrato (soluzione 10 mg/ml in acqua, soluzione 16,2 mM)	Invitrogen	H3570	470519
Microscopio fluorescente Zeiss Apotome Axiovert 200M	Carl Zeiss, Inc.
Transpass V	New England Biolabs	M2561S	0030709
Transpass D2	New England Biolabs	M2554S	0060802
SNAP-Cell TMR Star	New England Biolabs	S9105S	0010811
Plasmide di controllo pSNAP-ADBR2	New England Biolabs	N9178S	0010811
Plasmide di controllo pSNAP-H2B	New England Biolabs	N9179S	0010811