Articolo metodologico

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

DOI:

10.3791/1902

⸱

24 dicembre 2010

 ,  , 
1Molecular Cell Biology, Weizmann Institute of Science

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microscopia multiphoton permette il controllo di fotoni a bassa energia con profonda penetrazione ottica e fototossicità ridotto. Descriviamo l'uso di questa tecnologia per l'etichettatura delle cellule vive in embrioni di zebrafish. Questo protocollo può essere facilmente adattato per foto-induzione di varie molecole di luce-sensibile.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotoattivazione di composti target in un organismo vivente si è dimostrato un valido approccio per studiare vari processi biologici quali lo sviluppo embrionale, segnalazione cellulare e la fisiologia adulta. A questo proposito, l'uso del multi-fotone microscopia permette fotoattivazione quantitativa di un dato agente luce reattivo nei tessuti profondi con una risoluzione singola cella. Come embrioni di zebrafish sono otticamente trasparenti, il loro sviluppo può essere monitorata in vivo. Queste caratteristiche rendono il pesce zebra un organismo modello perfetto per controllare l'attività di una varietà di agenti chimici e le proteine ​​dalla luce concentrata. Qui si descrivono l'uso della microscopia a due fotoni per indurre l'attivazione di chimicamente in gabbia fluoresceina, che a sua volta ci permette di seguire il destino delle cellule in vivo embrioni di zebrafish. Noi usiamo gli embrioni che esprimono un punto di riferimento vivo genetica (GFP) per individuare con precisione obiettivi e le cellule di interesse. Questa procedura può essere utilizzata allo stesso modo per un preciso attivazione luce indotta di proteine, ormoni, molecole di piccole dimensioni e altri composti in gabbia.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo un protocollo di etichettatura delle cellule utilizzando fluoresceina in gabbia, però, altre foto-attivabili coloranti e proteine ​​possono essere utilizzate allo stesso modo.

1. L'iniezione di fluorescina Caged

  1. Preparare soluzione madre 5% (5 mg in gabbia-fluoresceina / 100 microlitri KCl 0,2 M) di destrano coniugato 4,5-dimetossi-2-nitrobenzyl (DMNB) in gabbia fluoresceina (10.000 MW destrano, anionici, Invitrogen, sonde molecolari, Carlsbad, CA , cat. no. D-3310). Aliquota e conservare in -20 ° C. Si noti che DMNB-gabbia fluoresceina è sensibile alla luce e dovrebbe essere tenuto al buio.
  2. Preparare ....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Photo-attivabili composti sono molecole la cui funzione è mascherato fino a quando non sono illuminati con una specifica lunghezza d'onda (di solito UV), inducendo una reazione fotochimica che converte le molecole in uno stato chimicamente o biologicamente attive. Queste sonde forniscono strumenti molto potenti per la ricerca di biologia delle cellule, poiché l'attivazione può essere controllato con precisione temporalmente e spazialmente, limitando la loro esposizione alla luce.

Il .......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grazie sono dovuti a Genia Brodsky per la figura grafica; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, e Leonid Roitman per la consulenza tecnica e assistenza con i due fotoni uncaging; Maayan tahor e Suliman Elsadin di assistenza tecnica; Uwe Strahle per la gentile fornitura della linea neurogenin1 reporter e Amos Gutnick dei commenti a questo manoscritto. La ricerca in laboratorio Levkowitz è supportato dal tedesco-israeliano Foundation (codice di autorizzazione 183/2007); Israel Science Foundation (codice di autorizzazione 928/08) e la Harriet & Marcel Dekker Foundation. GL è un operatore della Cattedra Career Development Tauro nella ricerca biomedica.

....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fluoresceina incapsulata in dextrano coniugata con 4,5-dimetossi-2-nitrobenzile (DMNB) (dextrano 10.000 MW, anionico)InvitrogenD-3310molecular probes
Agarosio per canale di iniezione e piastre rivestiteSigma-AldrichA9539
Capillari di vetro sottili con filamento internoWorld Precision Instruments, Inc.TW100F-6
Tiratore di micropipetteSutter Instrument Co.P-97
Punta MicroloaderEppendorf5242 956.003
Pompa pneumatica picopompaWorld Precision Instruments, Inc.PV820
Feniltiourea (PTU)Sigma-Aldrich22290-9
Agarosio a basso punto di fusione per il montaggio di embrioniUltra Pure LMP agarose16520100
Frammenti Fab anti-fluoresceina coniugati con fosfatasi alcalina (AP)Roche Group11426338910
Fast RedRoche Group11496549001

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. (1995).
  2. Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
  3. Russek-Blum, N.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Microscopia a due fotoniTecnica di fotoattivazioneFluoresceina in gabbiaRisoluzione a singola cellulaPunto di riferimento GFPAgarosio a basso punto di fusioneMicroscopia confocaleColorazione anti fluoresceinaMontaggio dell embrione

Articoli correlati