Questo protocollo descrive un approccio generale per eseguire fotoconversione di proteine fluorescenti su un microscopio confocale a scansione laser. Si descrivono le modalità per la fotoconversione di campioni di proteine puried, nonché per evidenziare ottici a doppia sonda in cellule vive con mOrange2 e Dronpa.
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Articolo metodologico
Fotoconversione di proteine purificate fluorescenti ed evidenziazione ottica dual-sonda in cellule vive
In questo articolo
Sommario
Abstract
Photoconvertible proteine fluorescenti (pc-PQ) sono una classe di proteine fluorescenti con "ottica evidenziatore" capacità, il che significa che il colore della fluorescenza può essere cambiato l'esposizione alla luce di una specifica lunghezza d'onda. Evidenziando ottico permette la marcatura non invasiva di una sottopopolazione di molecole fluorescenti, ed è quindi ideale per il monitoraggio singole cellule o organuli.
Parametri critici per fotoconversione efficiente sono l'intensità e il tempo di esposizione della luce fotoconversione. Se l'intensità è troppo bassa, fotoconversione sarà lenta o non verificarsi affatto. D'altra parte, l'intensità troppo o troppo a lungo possibile l'esposizione photobleach la proteina e quindi ridurre l'efficienza della fotoconversione.
Questo protocollo descrive un approccio generale come impostare un microscopio confocale a scansione laser per pc-FP applicazioni fotoconversione. In primo luogo, si descrive una procedura per la preparazione di campioni di gocce di proteine purificate. Questo formato campione è molto conveniente per lo studio del comportamento fotofisiche di proteine fluorescenti al microscopio. In secondo luogo, useremo il campione goccia proteina per mostrare come configurare il microscopio per fotoconversione. E, infine, mostreremo come di evidenziare la ottici in cellule vive, inclusa l'evidenziazione ottica dual-sonda con mOrange2 e Dronpa.
Protocollo
1. Preparazione dei campioni goccia proteina fluorescente
Una goccia proteina fluorescente del campione è costituito da una emulsione 1-octanol/water con la proteina fluorescente che risiedono nella fase acquosa. Questa emulsione è inserita tra un vetrino da microscopio e un quadrato 22 mm di vetro di copertura per le applicazioni di microscopia.
- Prima di effettuare campioni goccia proteina fluorescente il vetrini e vetri di copertura devono essere puliti e rivestiti con un agente idrofobo.
- Pulire vetro lavando 5 minuti con acetone e lasciare asciugare per via aerea. (In alternativa, dopo aver pulito il vetro può esse....
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Discussione
Il campione purificato goccia proteina fluorescente è un formato di campione molto comodo per la caratterizzazione fotofisiche di proteine fluorescenti, ad esempio per studiare photobleaching cinetica e cinetica fotoconversione. Il volume delle gocce estremamente piccole (~ 20 picolitri) facilita photobleaching ed esperimenti fotoconversione, che può essere difficile da eseguire in sistemi basati cuvetta. Inoltre, come mostrato qui il campione goccia è ideale per la creazione di un microscopio confocale per le applica.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo Mike W. Davidson (Florida State University) per aver fornito il DNA plasmide codifica proteine fluorescenti. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health concedere GM72048 (a DWP).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vetrini per microscopio | VWR international | 48312-003 | |
| Vetrocopri da 22 mm | Corning | 2940-245 | |
| 1-ottanolo | Sigma-Aldrich | O4500 | |
| metiltrimetossilano | Sigma-Aldrich | M6420 | |
| Piastre MatTek | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | |
| Lipofectamina2000 | Invitrogen | 11668-019 |
Riferimenti
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
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Ristampe e permessi
