Montaggio di cervelli di Drosophila adulta: un metodo per preparare vetrini per l'imaging confocale

Questo protocollo è un estratto da Kelly et al., Dissezione e colorazione immunofluorescente del corpo del fungo e dei neuroni fotorecettori nei cervelli adulti di Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montaggio di cervelli adulti di D. melanogaster su vetrini per microscopio e imaging

1. Costruisci una diapositiva "ponte". Posizionare due vetrini coprioggetti "base" a circa 1 cm di distanza l'uno dall'altro su un vetrino caricato positivamente. Assicurarsi che il lato caricato positivamente della guida sia rivolto verso l'alto. Far aderire i vetrini coprioggetti al vetrino con lo smalto per unghie come mostrato in Figura 1A. Di solito è utile sigillare i tre bordi esterni di ciascun vetrino coprioggetto di base con smalto per unghie per assicurarsi che il supporto di montaggio non si allontani sotto questi vetrini copri base. Lasciare asciugare completamente lo smalto (10 - 15 min) prima di procedere.
2. Posizionare il vetrino sotto lo stereomicroscopio e pipettare la soluzione del terreno di montaggio contenente i cervelli sezionati nello spazio tra i due vetrini. Per fornire un maggiore contrasto, è utile manovrare le luci a collo d'oca in modo che siano parallele al piano del banco.
3. Rimuovere il supporto di montaggio aggiuntivo dal vetrino utilizzando una pipetta, facendo attenzione a non pipettare il cervello dal vetrino.
4. Elimina i supporti di montaggio extra. Ciò consentirà di posizionare il cervello in modo più preciso durante la fase successiva.
5. Usando un paio di pinze e lo stereomicroscopio, posizionare il cervello sul vetrino in uno schema a griglia con i lobi antennali rivolti verso l'alto.
6. Posiziona un vetrino coprioggetti (il "ponte") sul cervello (Figura 1A). Usa lo smalto per unghie per sigillare i lati del copriponte nel punto in cui entrano in contatto con i vetrini di copertura "base".
7. Utilizzando una pipetta p200, riempire lentamente la cavità centrale sotto il ponte con un nuovo terreno di montaggio (Figura 1B). Posizionare una goccia alla volta sul bordo aperto del vetrino coprioggetti centrale e lasciare che il supporto di montaggio si muova sotto il vetrino coprioggetti del ponte centrale. Continua fino a quando l'intera cavità non è riempita con il supporto di montaggio, quindi sigilla la parte superiore e inferiore con uno smalto trasparente.
8. Una volta che lo smalto per unghie è asciutto, fotografare immediatamente i vetrini o conservarli in una scatola per vetrini a tenuta stagna e resistente alla luce a -20 °C.
9. Entro una settimana, l'imaging del cervello utilizza un microscopio confocale a scansione laser con laser di eccitazione e cubi filtranti appropriati per gli anticorpi secondari fluorescenti scelti. Le immagini Z-stack dei neuroni del corpo dei funghi sono tipicamente ottenute utilizzando obiettivi 20X o 40X. L'imaging dei neuroni fotorecettori retinici può richiedere un ingrandimento maggiore.

Figura 1: Montaggio di cervelli in preparazione per l'imaging in immunofluorescenza. (A) I cervelli sono montati su vetrini SuperFrost Plus con una copertura del ponte per evitare l'appiattimento dei cervelli. Due vetrini coprioggetti "base" vengono fatti aderire a un vetrino Superfrost Plus caricato positivamente con smalto trasparente per unghie e i cervelli sezionati vengono quindi posizionati sul vetrino tra di loro. Un vetrino coprioggetti trasparente "a ponte" viene posizionato sopra il cervello e fatto aderire ai vetrini coprioggetto di base. (B) Una volta che lo smalto si è asciugato, Vectashield viene pipettato lentamente sotto il ponte per preservare la fluorescenza dell'anticorpo secondario. Lo smalto trasparente per unghie viene quindi utilizzato per sigillare la parte superiore e inferiore del vetrino coprioggetti "a ponte". Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.