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Questo protocollo è un estratto da Zhang et al, The C. elegans Intestino come modello per la morfogenesi del lume intercellulare e la biogenesi della membrana polarizzata in vivo a livello di singola cellula: etichettatura mediante colorazione degli anticorpi, analisi della perdita di funzione dell'RNAi e imaging, J. Vis. Exp. (2017).
Colorazione degli anticorpi dell'intestino di C. elegans
- fissazione
- Prendi un vetrino pulito e usa la poli-L-lisina per generare una pellicola sottile su cui i vermi possono attaccarsi. Posizionare 30 μL di poli-L-lisina allo 0,1-0,2% sul vetrino e posizionare un secondo vetrino sulla goccia di poli-L-lisina per fare un "sandwich". Quindi strofinare delicatamente le diapositive un paio di volte per bagnare l'intera superficie di entrambe e lasciarle asciugare all'aria per 30 minuti. Etichettare il lato smerigliato delle diapositive con pencil.
NOTA: aliquote di poli-L-lisina allo 0,2% di 200 μL sono state prodotte sciogliendo la polvere in dH2O; questo può essere conservato a -20 °C. Utilizzare poli-L-lisina ad alto peso molecolare per una migliore adesione dei vermi. Anche la concentrazione di poli-L-lisina è fondamentale. Concentrazioni troppo basse non permetteranno ai vermi di attaccarsi, ma concentrazioni troppo alte possono generare un segnale di fondo di fluorescenza. Una pellicola troppo spessa può allentarsi nella sua interezza.
- Posizionare saldamente un blocco metallico piatto sul fondo di un contenitore (ad es. un contenitore di polistirolo) riempito con azoto liquido.
NOTA: Si può usare invece il ghiaccio secco, ma l'azoto liquido mantiene un blocco di metallo più stabile sul fondo del contenitore e si raffredda bene.
- Raccogli i vermi lavandoli via dai loro piatti con M9 o raccogli diversi vermi da stadio (uova, vermi da stadio larvale L1, L2, L3 o L4) su ogni vetrino. In genere, scegli ~ 100 larve ed embrioni o ~ 20 adulti per ogni vetrino. Posizionare 10 μL di vermi lavati via al centro del vetrino o raccogliere le uova/vermi in 10 μL di M9 o 10 μL di 1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato).
- Utilizzare una pipetta per distribuire un gran numero di vermi per evitare la formazione di grumi.
Nota: le popolazioni miste di vermi lavati via, a causa dell'affollamento e del diverso spessore degli stadi, non aderiscono bene e sono meno efficacemente congelati (vedi sotto), quindi la raccolta di vermi specifici per stadio (o popolazioni sincronizzate) dà risultati superiori. Le larve si attaccano meglio degli adulti e si possono posizionare più animali per scivolo.
- Prima di prelevare i vermi sui vetrini, trasferirli su una piastra NGM (Nematode Growth Medium) priva di batteri OP50. Anche l'eccesso di batteri aderenti ai vermi può interferire con l'adesione. Fare attenzione che i vermi non si secchino.
- Posizionare delicatamente (far cadere) un vetrino coprioggetti da 22 mm × 22 mm a croce sopra i vermi raccolti in modo che i suoi bordi pendano su almeno un lato del vetrino. Premere delicatamente ma con decisione con una o due dita sul vetrino coprioggetti. Evitare il taglio che danneggerebbe l'integrità dei tessuti.
- Trasferire immediatamente e delicatamente il vetrino sul blocco metallico in azoto liquido e lasciarlo riposare per circa 5 minuti a congelare. Quindi "sfiora" il vetrino coprioggetti con una sola mossa rapida utilizzando il bordo sporgente.
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito con decisione e mentre il vetrino è congelato per ottenere la "fessurazione" della cuticola. Attenzione: Si prega di seguire le linee guida sui DPI (Dispositivi di Protezione Individuale) quando si lavora con azoto liquido.
- Immergere i vetrini liofilizzati in un barattolo di vetro Coplin pieno di metanolo per 5 minuti a -20 °C. Quindi trasferire in un barattolo di vetro Coplin pieno di acetone per altri 5 minuti a -20 °C.
NOTA: Il metanolo e l'acetone devono essere conservati a -20 °C per almeno 30 minuti prima dell'uso. Dopo il fissaggio, i vetrini possono essere conservati a -20 °C.
ATTENZIONE: il metanolo e l'acetone sono tossici.
- Rimuovere i vetrini dal barattolo e lasciarli asciugare all'aria a temperatura ambiente (RT) prima dell'uso.