Questo protocollo è estratto da Teoh et al, Approcci quantitativi per lo studio delle strutture cellulari e della morfologia degli organelli in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
Preparazione dei vetrini per l'imaging
- Preparare il 3-4% p/v di brodo di agarosio in un flacone adatto al microonde (3-4 g in 100 ml di acqua ultrapura).
NOTA: L'agar può essere utilizzato al posto dell'agarosio alla stessa concentrazione.
- Sciogliere accuratamente l'agarosio in un forno a microonde, facendo attenzione a non far bollire troppo, fino a quando tutto l'agarosio si sarà sciolto (soluzione limpida). Conservare la soluzione a 70 °C per evitare la solidificazione.
NOTA: Il brodo di agarosio può essere utilizzato più volte. Riscaldare prima dell'uso se l'agarosio si è solidificato.
- Utilizzando una pipetta Pasteur, posizionare una goccia di agarosio fuso su un vetrino da microscopio.
NOTA: Evitare di avere bolle d'aria nella goccia di agar poiché queste interrompono l'integrità del pad.
- Premere immediatamente la gocciolina di agarosio con un altro vetrino da microscopio, appiattendo delicatamente in un tampone tra i due vetrini.
NOTA: Eventuali bolle rimanenti devono essere rimosse in questa fase. In caso contrario, è necessario creare nuovi scivoli poiché gli animali possono facilmente rimanere bloccati nelle bolle. Evitare il trabocco dell'agar lateralmente quando si preme sul vetrino.
- Lasciare asciugare l'agarosio per 1 minuto.
- Separare accuratamente i due vetrini per evitare danni all'agarosio, lasciando il tampone solidificato su uno dei vetrini.
NOTA: I vetrini con cuscinetti di agarosio devono essere sempre preparati freschi appena prima dell'esperimento in quanto possono seccarsi. Assicurati che il tampone di agarosio abbia uno spessore costante. Non dovrebbero esserci bolle d'aria o crepe nel pad in quanto ciò potrebbe interferire con l'imaging.
- Aggiungere una piccola goccia (5-10 μl) di tetramisolo cloridrato allo 0,05% (anestetico) al centro del tampone di agarosio.
- Utilizzando un plettro sterilizzato a caldo, trasferire rapidamente circa 10-15 animali dalla piastra di riserva alla gocciolina di anestetico prima che la soluzione si asciughi. Evitare di trasferire troppi batteri OP50 in quanto ciò rende la soluzione torbida, che può interferire con l'imaging.
NOTA: Se la soluzione anestetica si asciuga durante il prelievo, è sufficiente pipettare una seconda goccia di tetramisolo cloridrato allo 0,05% sugli animali. Gli animali tendono a sdraiarsi sul lato laterale nella soluzione anestetica.
- Applicare un vetrino coprioggetti posizionandolo appena sopra il tampone di agarosio e lasciandolo cadere delicatamente verso il basso. Ciò eviterà la formazione di bolle. Non esercitare pressione sul vetrino coprioggetti in quanto ciò potrebbe schiacciare gli animali.
- Etichettare i vetrini con il nome del ceppo.
