$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Questo protocollo è un estratto da Tauc et al., Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging, J. Vis. Exp. (2014).
NOTA: Se questo protocollo viene utilizzato per la prima volta per isolare gli ISC mediante ordinamento FAC, i seguenti controlli sono obbligatori per impostare inizialmente correttamente i parametri FACS: Cellule dissociate da midguts di Drosophila wild type (es. w1118) senza Sytox. Cellule dissociate da Drosophila midguts di tipo selvatico (ad es. w1118) con Sytox (vedi Passaggio 3.6). Cellule dissociate dall'intestino medio della linea di mosca esg-Gal4, UAS-GFP senza Sytox.
1. Preparazione di soluzioni e piatti per la dissezione intestinale
- Preparare 4-6 fiale contenenti ciascuna 40 mosche femmina della lenza esg-Gal4, UAS-GFP.
- Da una soluzione madre 10x PBS preparare 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH2PO4·H2O, 8,4 mM Na2HPO4·2H2O, 175 mM NaCl, regolare il pH a 7,4).
- Preparare una soluzione di agarosio al 3,5% in 1x PBS (3,5 g di agarosio per elettroforesi in 100 ml 1x PBS). Preparare le piastre di dissezione versando questa soluzione in piastre di Petri (diametro 8,5 cm) fino a coprire il fondo. Lo strato di agarosio impedisce di danneggiare le punte delle pinze durante la procedura di dissezione. Dopo che il gel si è solidificato, conservare le piastre di dissezione a 4 °C.
- Preparare 300 ml di 1x PBS + 1% BSA fresco prima di sezionare e posizionare il flacone su ghiaccio o a 4 °C.
- Accendete la centrifuga e lasciatela raffreddare a 4 °C.
- Fiammeggiare le punte di 2 pipette di vetro Pasteur per levigare i bordi.
- Pulisci due paia di pinze e una lama di rasoio con etanolo al 70%.
- Posizionare da quattro a sei provette per microcentrifuga da 1,5 ml per raccogliere l'intestino medio sezionato sul ghiaccio.
2. Preparazione del tratto gastrointestinale e dissezione dell'intestino medio
- Anestetizzare i moscerini da una fiala (40 mosche) con CO2 su un lettino standard, decapitare tutti i moscerini con una lama di rasoio e trasferirli nella capsula di dissezione. Versare 1 soluzione fredda di PBS/1% BSA nella capsula di dissezione per coprire il gel di agarosio. Le mosche galleggeranno.
- Afferra l'addome della mosca con un paio di pinze, mentre tieni il torace con l'altro paio di pinze. Separare il torace dall'addome. L'intestino sarà visibile e l'intestino anteriore/il raccolto molto probabilmente saranno ancora collegati al torace.
- Afferra l'intestino ed estrailo dal torace. Per aprire l'intestino, afferra il raccolto e tira l'intestino leggermente anteriormente lontano dall'addome.
- Afferra l'estremità posteriore dell'addome con un paio di pinze e il bordo della cuticola aperta anteriormente con l'altro paio di pinze. Fare attenzione a non distruggere il tessuto intestinale sporgente. Tirare via l'estremità posteriore per rompere la cuticola e continuare a tirare posteriormente molto delicatamente fino a quando l'intero intestino non è stato estratto dalla cavità addominale. Potrebbe essere necessario rimuovere il raccolto in anticipo se è troppo grande per passare attraverso la cavità del corpo.
- Eliminate l'intestino anteriore, i tubuli malpighiani, l'intestino posteriore e le ovaie lasciando l'intestino medio nudo.
- Utilizzando una pipetta di vetro Pasteur, trasferire il lotto di intestino medio sezionato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml contenente 1 soluzione fredda di PBS/1% BSA e mantenere la provetta sul ghiaccio. I campioni devono essere elaborati entro 2 ore.
- Al termine della dissezione di un intero lotto, sciacquare la vaschetta di dissezione con acqua distillata doppia per lavare via i detriti rimanenti. Inizia a sezionare il prossimo lotto di intestino medio (ripeti i passaggi 2.1-2.7). Sezionare il maggior numero possibile di lotti entro 2 ore, quindi procedere al passaggio 3.1.
3. Digestione del tessuto intestinale per raccogliere le cellule per lo smistamento FAC
- Rimuovere la soluzione 1x PBS/1% BSA dall'intestino medio e aggiungere 500 μl di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,5% a ciascun campione.
- Agitare bene per 20 secondi e incubare i campioni oscillando/ruotando delicatamente a 20 giri/min a temperatura ambiente per 25-30 minuti.
- Vorticare di nuovo dopo circa 30 minuti e lasciare che il tessuto intestinale medio intatto affondi sul fondo del tubo. Rimuovere con cautela le cellule che sono in sospensione con una pipetta Pasteur in vetro fiammato e filtrarle attraverso una rete di nylon da 35 μm in una provetta da microcentrifuga fresca da 1,5 ml.
- Centrifugare le celle a 100 x g per 5 minuti a 4 °C. Da notare che, quando si avvia il digest, un pellet cellulare potrebbe non essere visibile all'inizio, ma lo diventerà man mano che il digestato dei tessuti progredisce.
- Trasferire con cautela la soluzione di tripsina nella provetta originale contenente il tessuto intestinale medio intatto rimanente. Evitare di trasferire troppe celle dal pellet.
- Risospendere delicatamente il pellet della cella in 400 μl di 1x PBS/1% BSA freddo. Tenere le provette da microcentrifuga contenenti le cellule dissociate sul ghiaccio e coprire le provette con un foglio di alluminio per proteggere le cellule dalla luce.
- Agitare nuovamente la soluzione di tripsina contenente il tessuto intestinale medio intatto rimanente e posizionare i campioni sul bilanciere per altri 30 minuti a temperatura ambiente.
- Ripetere i passaggi da 3.3 a 3.4.3 fino a quando tutto il tessuto dell'intestino medio è stato digerito. Combinare le cellule dissociate di tutte le provette per microcentrifuga in un'unica provetta per microcentrifuga. Ciò può richiedere una fase di centrifugazione come in 3.4, poiché il volume di tutte le sospensioni cellulari combinate può superare 1,5 ml. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio e proteggere le cellule dalla luce.
- Centrifugare le cellule dissociate a 100 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere con cautela la maggior quantità possibile di surnatante, lasciando circa 50-100 μl della soluzione 1x PBS/1% BSA nella provetta da microcentrifuga. Risospendere delicatamente le cellule dissociate in 800 μl di 1x PBS/1% BSA contenente Sytox (1:20.000).
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta Falcon a fondo tondo da 5 ml filtrando le cellule attraverso un tappo a scatto per filtro cellulare (rete di nylon da 35 μm). Conservare sempre i campioni di cellule sul ghiaccio e al riparo dalla luce. Le celle sono ora pronte per essere ordinate.
- Pipettare 600 μl di soluzione RNAlater in ciascuna provetta per microcentrifuga in cui le cellule verranno smistate per il successivo isolamento dell'RNA. Per altre applicazioni a valle, le cellule possono essere raccolte in una soluzione diversa, ad esempio in PBS sterile.