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Il seguente protocollo è un estratto da Cornwell et al, The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan, J. Vis. Exp. (2018).
1. Prevenire la produzione di progenie con l'aggiunta di 5-Fluoro-2'-deossiuridina (FUdR)
- Far crescere gli animali fino allo stadio L4 a 20 °C. Controllare se gli animali sincronizzati si sono evoluti a L4 circa 40 ore dopo la semina (passaggio 2.1.7).
NOTA: Il tempo di sviluppo di C. elegans varierà a diverse temperature e i tassi di crescita degli animali mutanti per i quali non sono stati caratterizzati i tassi devono essere testati empiricamente.
- Aggiungere 160 μl di FUdR 50x a ciascuna piastra da 6 cm con animali L4.
NOTA: È fondamentale aggiungere FUdR nella fase L4. Per comodità, preparare 1.000 scorte di FUdR sciogliendo 1 g di FUdR in 10 mL di H2O ultrapuro. Filtrare-sterilizzare il FUdR madre con un filtro da 0,2 μm e una siringa da 10 cc. Aliquotare ~1 mL di stock in provette sterili da 1,5 mL. Congelare e conservare a -20 °C.
- Ispezionare le piastre per verificare la presenza di C. elegans maschio. Rimuovere tutti i maschi.
NOTA: La durata della vita è tipicamente misurata per gli ermafroditi e non per i maschi. Gli ermafroditi che si accoppiano vivono meno brevemente degli animali non accoppiati, anche in presenza di FUdR. I maschi sono più piccoli e più sottili degli ermafroditi e possono essere facilmente identificati da una caratteristica coda uncinata.
- Rimetti la scatola nella busta con chiusura a zip. Riportare all'incubatore a 20 °C.
2. Fattibilità del punteggio
- Segna la vitalità ogni giorno toccando delicatamente l'animale sulla testa con un filo di platino o una ciglia. Segna gli animali che non si muovono come morti e rimuovili dal piatto (Figura 1A). Registra il numero di morti osservati per ogni condizione per ogni punto temporale di osservazione.
NOTA: Per ridurre il rischio di distorsione del punteggio, lo sperimentatore deve rimanere cieco alle condizioni sperimentali e allo stesso modo non deve fare riferimento ai risultati dei punti temporali precedenti durante il punteggio.
- Censurare gli animali che si rompono, muoiono a causa di altri evidenti difetti di sviluppo o si arrampicano sul lato del piatto: rimuovete questi animali e registrate il numero in ogni punto temporale osservato per prenderne in considerazione l'analisi statistica. Inoltre, se vengono trovati maschi, rimuovili e registra il numero osservato.
- Ripetere dal passaggio 2.1 ogni giorno fino a quando non rimangono più animali.
NOTA: Se il prato di E. coli diminuisce in modo significativo o i funghi iniziano a crescere sulla piastra, trasferire tutti gli animali rimanenti in una piastra fresca con l'RNAi e il FUdR appropriati.
