C. elegans Test di sopravvivenza: un test di tossicità a breve termine

Abstract

Fonte: Possik, E. e Pause, A. Misurazione della resistenza allo stress ossidativo di Caenorhabditis elegans in piastre per microtitolazione a 96 pozzetti.J. Vis. Exp. (2015).

Questo video presenta un test di sopravvivenza a breve termine che verifica la tossicità acuta di un trattamento o la resistenza di un ceppo genetico a una condizione tossica. Il protocollo di esempio mostra un esempio di test di sopravvivenza in cui i vermi vengono testati per la loro capacità di resistere allo stress ossidativo indotto dal paraquat (PQ).

Protocollo

Questo protocollo è un estratto da Possik e Pause, Misurazione della resistenza allo stress ossidativo di Caenorhabditis elegans in piastre per microtitolazione a 96 pozzetti, J. Vis.(2015).

1. Esecuzione del saggio di resistenza allo stress ossidativo

1. Pipettare 40 μl della soluzione 100 mM PQ (preparata fresca) in ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. Utilizzare almeno 12 pozzetti come repliche di ogni condizione (trattamento, mutante, ecc.). Usando un plettro di platino, trasferisci 5-8 larve di animali L4 in ogni pozzo indicando l'ora di inizio e l'ora di fine.
2. Quando si avvia un'altra condizione, annotare l'ora di inizio e l'ora di fine. Porre la piastra a 20 °C nel tempo di incubazione tra il trasferimento dei vermi e il punteggio degli animali morti un'ora dopo l'ora di inizio.
3. Utilizzando il microscopio da dissezione, contare la sopravvivenza ogni ora. Agitare delicatamente la piastra prima di iniziare a contare. Indica i vermi che non si muovono, anche dopo aver individuato una luce ad alta intensità, come animali morti. Indicare anche il numero di animali vivi.
   NOTA: Osservando la forma del verme, la coda e il movimento della testa ad alto ingrandimento, aiuta a determinare i vermi morti da vivi.
4. Ripeti questo passaggio ogni ora fino a quando la maggior parte dei vermi non è morta.

2. Determinazione della percentuale di sopravvivenza in ogni punto temporale

1. Calcola il numero totale di animali per condizione sommando il numero totale di animali trasferiti in ogni pozzo. Ignora gli animali che vengono danneggiati o uccisi durante il trasferimento.
2. Per ogni punto temporale, calcola il numero totale di animali morti per condizione (somma degli animali morti nei 12 pozzi). Per ogni punto temporale, calcola la percentuale di morte (numero di animali morti diviso per il numero totale di animali e moltiplicato per 100) e la percentuale di sopravvivenza (100 meno la percentuale di morte).
3. Ripetere questo test almeno 3 volte indipendenti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microscopio stereo Zeiss Discovery v8	Zeiss
Piastra per microtitolazione trasparente a 96 pozzetti