Digestione enzimatica e dissociazione manuale: un metodo per preparare gli embrioni di C. elegans per la coltura cellulare

Abstract

Fonte: Sangaletti, R. e Bianchi, L. Un metodo per la coltura di cellule embrionali di C. elegans.J. Vis. Exp.(2013).

Questo video introduce un metodo per isolare e coltivare sterili cellule embrionali di C. elegans in vitro.

Protocollo

1. Dissociazione delle cellule embrionali

1. Condurre le fasi successive della procedura in condizioni sterili utilizzando una cappa a flusso laminare. Mentre gli animali sono vestiti su piastre batteriche, i lavaggi e il trattamento con la soluzione di lisi contenente candeggina dovrebbero eliminare la maggior parte, se non tutti, i batteri. Pertanto, l'utilizzo di una cappa laminare a questo punto della procedura impedisce una nuova contaminazione della sospensione dell'uovo.
2. Risospendere gli ovuli pellettati in 1 ml di chitinasi 2 mg/ml (riserva in tampone uovo pH 6,5) e trasferirli in una nuova provetta conica sterile da 15 ml. Agitare il tubo per 10-30 minuti a temperatura ambiente. Il tempo esatto di incubazione cambia in base alla freschezza dell'enzima e alla temperatura della stanza e deve quindi essere determinato per ogni preparazione. Si consiglia di iniziare a monitorare le uova con un microscopio per colture cellulari invertite dopo 10 minuti di incubazione. Nota: nella nostra esperienza, un pH basso aumenta l'attività enzimatica della chitinasi. Per questo motivo utilizziamo tampone uovo a pH 6,5 per sciogliere la chitinasi (ricetta riportata sopra, dove il pH viene regolato a 6,5 utilizzando NaOH).
3. Quando ~ 80% dei gusci d'uovo viene digerito dal trattamento con chitinasi (Figure 1 A-B), pellettare le uova mediante centrifugazione a 900 x g (~2.500 giri/min) per 3 minuti. Utilizzando un pipettatore P1000 e puntali sterili, rimuovere con cura il surnatante e aggiungere 3 ml di terreno L-15.
4. Trasferire gli ovuli in una piastra di 6 cm di diametro e dissociare delicatamente le cellule utilizzando una siringa sterile da 10 ml dotata di ago da 18 G. Monitorare il grado di dissociazione inserendo una goccia di sospensione in una capsula di Petri di plastica fresca e osservandola al microscopio. Non aspirare aria nella siringa durante questa procedura per evitare di danneggiare le cellule. Continuare la dissociazione fino a quando ~ 80% delle cellule è dissociato.
5. Filtrare la sospensione utilizzando un filtro sterile Millipore da 5 μm. Le sospensioni cellulari devono essere filtrate per rimuovere i grumi cellulari, le uova non digerite e le larve schiuse. Filtrare altri 4-5 ml di terreno L-15 fresco attraverso il filtro per recuperare tutte le cellule. Non esercitare una forza eccessiva durante la fase di filtrazione per evitare di danneggiare il filtro e/o le celle.

2. Coltivare le cellule

1. Pellettare le cellule dissociate mediante centrifugazione a 900 x g (~2.500 giri/min) per 3 minuti. Utilizzando un pipettatore P1000 e puntali sterili, rimuovere con cura tutto il surnatante. Risospendere le cellule pellettate in un terreno L-15 completo e piastra per 1 ml/pozzetto. La quantità del mezzo aggiunto dipende dal numero di 8P piastre utilizzate, la confluenza dei vermi sulle piastre e il tipo di esperimenti che verranno eseguiti sulle celle. La densità cellulare può essere determinata utilizzando un emocitometro. Per le registrazioni patch-clamp è ottimale una densità di placcatura di ~ 230.000 celle/cm².
2. Conservare la piastra da 24 pozzetti in un contenitore di plastica Tupperware contenente salviette di carta bagnate per evitare l'evaporazione del terreno di coltura. Conservare il contenitore in un'incubatrice umidificata a 20 °C e all'aria ambiente.
3. Le cellule sono solitamente pronte per gli esperimenti entro 24 ore, quando la differenziazione morfologica e l'espressione dei marcatori GFP sono complete. Le cellule possono essere conservate in coltura per un massimo di 2 settimane, ma di solito sono più sane fino a 7-9 giorni dopo la piastra. Il terreno deve essere sostituito una volta al giorno per mantenere le cellule sane.

Risultati

Figura 1. Embrioni di C. elegans prima e dopo il trattamento con chitinasi. (A) Fotografia delle uova prima dell'esposizione alla chitinasi. La freccia indica il guscio d'uovo trasparente e intatto che circonda un embrione. (B) Uova trattate con chitinasi per 10 minuti. I gusci d'uovo sono stati digeriti e non sono più visibili intorno agli emb...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
REAGENTI
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	Codice 11415-064
Siero Fetale Bovino	Invitrogen	Codice 16140-063
Penicillina-streptomicina	sigma	P4333-100ML
Chitinasi da Streptomyces Griseus	sigma	C6137-25UN
Lectina di arachidi	sigma	L0881-10MG
>ATTREZZATURA
101-1000 μl di punte per pipette graduate blu	USA Scentific	Codice 1111-2821
10 ml Pipetta Sterilizzata Incartata Singolarmente	USA Scentific	Codice 1071-0810
Pipettatore ergonomico a volume variabile (100-1000 μl) con espulsore di puntali	VWR International Inc.	89079-974
Ausilio portatile per pipette, Drummond	VWR International Inc.	Codice 53498-103
Transfer Pipetta in Plastica Sterile	VWR International Inc.	Codice 14670-114
15 ml Tubo Conico	USA Scentific	Anni 1475-1611
Aghi sterili calibro 18	Becton, Dickinson e Co.	305196
Siringhe sterili da 10 ml	Becton, Dickinson e Co.	305482
Filtri per siringhe in plastica Corning 0,20 μm dimensione dei pori	Corning	431224
Filtro per siringa acrodico da 25 mm con membrana versapor da 5 μm	VWR International Inc.	Codice 28144-095
60x15 mm Piastra di Petri Sterile	VWR International Inc.	82050-548
100x15 mm Piastra di Petri sterile	VWR International Inc.	82050-912
12 mm Diametri Vetrini Coprioggetti	VWR International Inc.	48300-560
Piastre per colture cellulari trasparenti Fondo piatto a 24 pozzetti con coperchio	Thomas scientifico	Codice 6902A09
Dumont #5- Pinze Fini	Strumenti per la scienza	Codice 11254-20
Centrifuga 5702	Eppendorf	22629883
Cappa a Flusso Laminare
Microscopio invertito con obiettivo x10
Incubatrice umidificata ad aria ambiente