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Il seguente protocollo è un estratto da Davies et al, Un saggio per misurare gli effetti dell'etanolo sulla velocità di locomozione di Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
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Passaggi da eseguire il giorno prima del test
- Raccogli i vermi dello stadio L4 su piastre fresche del terreno di crescita dei nematodi (NGM) seminate con un prato di OP50 E. coli e coltivali a 20 °C O/N. Ogni condizione di analisi richiede 10 vermi; raccogliere un eccesso di vermi per consentire la perdita di vermi O/N.
- Analizza solo gli animali che sono adulti del primo giorno; molti mutanti crescono a una velocità inferiore rispetto al tipo selvatico. Regola i tempi di raccolta per i ceppi che hanno ritardi nello sviluppo in modo che tutti gli animali testati siano adulti del primo giorno.
- Passaggi da eseguire il giorno del test
- Preparazione per il test:
- Esecuzione di saggi su piastre NGM standard non seminate da 60 x 15 mm. Asciugare tutte le piastre da utilizzare a 37 °C per 2 ore, senza coperchio. Per ogni prova sperimentale, utilizzare quattro piastre NGM essiccate; si tratterà delle piastre per il saggio dell'etanolo da 0 mM e 400 mM e delle relative piastre di acclimatazione.
NOTA: L'uso di piastre NGM è importante qui; Le differenze nella composizione delle piastre, in particolare la loro osmolarità, possono influenzare fortemente la risposta alla dose di etanolo sul comportamento, ciò è dovuto, almeno in parte, a variazioni della quantità di etanolo accumulata dagli animali. L'agar NGM è 160 mOsm.
- Dopo l'essiccazione, pesare ciascuna delle piastre NGM non seminate da utilizzare nel test e annotare il peso. Determinare il volume dei supporti nelle lastre in base al peso di una lastra vuota. Per approssimare la conversione del peso dell'agar in volume, si supponga che il terreno pesi lo stesso di un uguale volume d'acqua.
NOTA: I nostri risultati più coerenti sono stati riscontrati con terreni NGM che si sono disidratati a sufficienza da far sì che un volume originale di 10 ml abbia un volume post-essiccazione compreso tra 8,3 e 8,9 ml. Un'alternativa al tempo di asciugatura di 2 ore è quella di asciugare fino a quando le piastre non raggiungono questo intervallo di volume per tenere conto delle differenze nelle incubatrici.
- Fondere 4 anelli di rame (diametro interno di 1,6 cm) sulla superficie di ciascuna delle piastre per fungere da recinti per i diversi genotipi o gruppi di trattamento dei vermi. Afferrare ogni anello con una pinza e scaldare in una fiamma (una fiamma forte da un bruciatore Bunsen funziona bene) per circa 3 secondi. Posizionare immediatamente l'anello su una piastra tenendo ancora l'anello con la pinza per evitare che "salti".
- Assicurarsi che l'anello poggi in piano contro la superficie dell'agar premendo delicatamente con la pinza in diversi punti dell'anello. Quando si posiziona l'anello, fare attenzione a lasciare spazio per altri tre anelli.
- Fondere i tre anelli di rame aggiuntivi sulla superficie della lastra, avendo cura di posizionarli il più vicino possibile in modo che tutti e quattro si trovino nel campo visivo della fotocamera.
NOTA: Fare una buona sigillatura con l'agar è essenziale per mantenere i vermi negli anelli durante il test. È improbabile che gli anelli che saltano sulla piastra facciano la tenuta corretta con l'agar e possono sfregiare l'agar, il che consente ai vermi di scavare e interferisce con la visualizzazione dei vermi.
- Per ogni piastra di analisi preparare una piastra di "acclimatazione" di accompagnamento, che deve essere essiccata e senza semi e non riceverà etanolo. Posizionare quattro anelli di rame su queste piastre.
- Etichettare il fondo delle piastre accanto ad ogni anello con il ceppo di verme da utilizzare nell'anello, facendo attenzione a non scrivere nel campo visivo dell'anello stesso. Abbinare le etichette sulla piastra di analisi con la piastra di acclimatazione in dotazione.
- Calcolare la quantità di etanolo al 100% da aggiungere a ciascuna piastra di analisi in modo che la concentrazione finale sia di 0 mM o 400 mM di etanolo (peso/volume). Per ogni esperimento (n = 1), ci sarà una piastra di etanolo da 0 mM e una da 400 mM; Le piastre di acclimatazione non ricevono etanolo. Aggiungere l'etanolo, pipettandolo attorno alla superficie della piastra. Utilizzare una pellicola da laboratorio per sigillare la piastra e lasciarla equilibrare sul piano di lavoro per 2 ore.
- Trascorsa 1,5 ore, iniziare la fase di acclimatazione del saggio, fase 2.2.
- Eseguire il saggio di locomozione: Piastre di saggio
- Trasferire con cura 10 vermi di ciascun gruppo sperimentale al centro di un anello di rame sulla piastra di acclimatazione. A questo punto, rimuovi tutto il cibo visibile sull'agar raschiando delicatamente con il plettro per vermi. Variare l'ordine in cui i gruppi sperimentali vengono posizionati sulle piastre durante le prove sperimentali in modo che gli stessi ceppi non vengano messi sulle piastre nello stesso ordine tra le prove.
NOTA: L'obiettivo è quello di trasferire gli animali sulla piastra con quantità minime di cibo, perché se il cibo sulla piastra di acclimatazione viene trasferito sulla piastra di analisi, i vermi si aggregheranno attorno al cibo e l'effetto del farmaco sulla locomozione sarà oscurato.
- Fare attenzione a non rompere la superficie dell'agar con il piccone, poiché ciò consentirà ai vermi di scavare e interromperà il test. Incubare i vermi a RT per 30 minuti.
- Assicurarsi che ci sia un intervallo adeguato tra le iniziazioni di ciascuna piastra. Uno sperimentatore esperto può spostare 40 animali, 10/anello per 4 anelli in < 1,5 minuti, ma qualsiasi intervallo fino a 2 minuti è accettabile. Il test standard prevede la registrazione di filmati a 10-12 minuti e 30-32 minuti di esposizione sia per 0 mM che per 400 mM di etanolo.
- Avviare la piastra di acclimatazione per l'esposizione a 0 mM e la piastra di acclimatazione per l'esposizione a 400 mM a circa 2 minuti e 30 secondi di distanza per consentire il salvataggio del primo file di filmato prima dell'inizio del secondo filmato.
- Dopo il periodo di acclimatazione di 30 minuti, trasferire i vermi dalle piastre di acclimatazione alle piastre di analisi. Trasferire i vermi nelle piastre di analisi (0 mM o 400 mM di etanolo) nello stesso ordine in cui sono stati aggiunti alla piastra di acclimatazione, tenendo traccia dei tempi tra i completamenti di ciascuna piastra. Sigillare la piastra con una pellicola da laboratorio per ridurre al minimo la perdita di etanolo durante la vaporizzazione.
- Usa un movimento di raccolta con un piccone appiattito a bordo sottile per raccogliere i vermi sopra il piccone appiattito. Eseguire il trasferimento dei vermi dalla piastra di acclimatazione non seminata alla piastra di saggio senza l'uso di batteri, che è comunemente usato nel trasferimento dei vermi in quanto aiuta a incollare il verme al piccone.
NOTA: La velocità con cui gli animali vengono trasferiti in questa fase è molto importante perché i primi vermi sulla piastra saranno esposti all'etanolo più a lungo degli ultimi vermi aggiunti alla piastra e i punti temporali precedenti possono mostrare alcuni effetti dipendenti dal tempo. Questo è il motivo principale per la rotazione, i ceppi vengono posizionati su una piastra per primi attraverso le repliche sperimentali.
- Eseguire il saggio di locomozione: Riprese
- Utilizzare una combinazione microscopio/fotocamera che consenta l'imaging simultaneo di tutti e quattro gli anelli nel campo visivo (circa 42x42 mm2 quadrati), come un obiettivo per microscopio 0,5x, ingrandimento 0,8x e una fotocamera con un CCD da 2048x2048 pixel da 7,4 μm.
- Utilizza un'illuminazione uniforme su tutto il campo visivo, che facilita il riconoscimento degli oggetti al passo della soglia di intensità. Una retroilluminazione da 3"x3" funziona bene.
- Immaginate i vermi su una lastra posizionata con il lato del supporto rivolto verso l'alto (coperchio verso il basso), che genera un contrasto che viene perso quando si utilizza la retroilluminazione rispetto a una tradizionale sorgente di luce trasmessa dal microscopio.
- Prepara il software di analisi delle immagini per acquisire filmati time-lapse dei vermi in movimento. Impostare il software in modo che acquisisca immagini in scala di grigi a 12 bit ogni 1 secondo, come filmato di 2 minuti (120 fotogrammi). Per ridurre le dimensioni del file di output, pur mantenendo una risoluzione dell'immagine sufficiente, utilizzate una modalità di binning 2x2 per acquisire immagini da 1024x1024 pixel.
- Registra i filmati. Inizia a registrare un filmato di 120 fotogrammi della prima lastra (0 mM di etanolo) 10 minuti dopo che gli ultimi vermi sono stati posizionati su quella piastra. Salva il file del filmato.
- Registrare la seconda piastra (400 mM di etanolo). Ripetere questo processo per entrambe le lastre a partire da 30 minuti dopo che gli ultimi vermi sono stati posizionati sulla prima lastra (0 mM di etanolo) per catturare i punti temporali di 30-32 minuti per ogni esposizione.
NOTA: Attendere un tempo sufficiente per salvare i file di immagine dopo ogni sessione di acquisizione prima di iniziare la registrazione della lastra successiva da analizzare.
- Per rendere i film archiviati a prova di futuro e per consentire l'apertura e l'analisi di questi filmati da parte di altri programmi software di imaging open source di dominio pubblico, come ImageJ, è possibile convertire una copia di ciascun filmato in file TIFF a 8 bit e 256 in scala di grigi.
NOTA: Il software di analisi delle immagini qui descritto utilizza un formato di file proprietario.