Preparazione del tessuto cerebrale del mouse per la microscopia Immunoelectron

Sommario

Abbiamo descritto un protocollo per la perfusione transcardiac di topi, rimozione e sezionamento del cervello, così come colorazione immunoperossidasi, incorporando resina, ultrasottili e sezionamento delle sezioni cervello. Al termine di queste procedure, il materiale immunostained è pronto per l'esame con microscopia elettronica a trasmissione.

Abstract

Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è estremamente utile per la visualizzazione della microglia, scomparti oligodendrocytic, astrociti, neuroni e subcellulare (dendrite, spine dendritiche, assone, assone terminale, pericarion), così come i loro organelli intracellulari e citoscheletro, nel sistema nervoso centrale a ad alta risoluzione spaziale. In combinazione con TEM, pre-embedding immunocitochimica consente la discriminazione di elementi cellulari con pochi tratti distintivi e dei criteri di identificazione (ad esempio microglia perikarya e processi, quando si utilizza un anticorpo contro la microglia specifico marcatore Iba1 (ionizzato molecola adattatrice calcio vincolante 1; presentato qui)), che indicano il contenuto neurotrasmettitore degli elementi cellulari (ad esempio, serotoninergici) e la loro localizzazione ultrastrutturale di proteine ​​solubili o di membrana (ad esempio, 5 HT1A e EphA4 recettori). Qui, descriviamo un protocollo per la perfusione transcardiac di topi con acroleina fissativo, rimozione e sezionamento del cervello, così come immunoperossidasi-diaminobenzidina (DAB) colorazione, l'incorporamento resina, ultrasottili e sezionamento delle sezioni cervello. Al termine di queste procedure, il materiale immunostained è pronto per l'esame con TEM. Quando rigorosamente eseguito, questa tecnica offre un ottimo compromesso tra ottimale conservazione ultrastrutturali e rilevamento immunocitochimica.

Protocollo

1. Animal perfusione

1. Il giorno prima di perfusione, preparare:
   - 2 L di tampone fosfato (PB, 100 mM, pH 7,4) e 1 l di sodio PBS (PBS, 0.9% NaCl nel PB 50 mM, pH 7,4) in acqua bidistillata. Conservare il PBS e 1L di PB a 4 ° C. Questi saranno utilizzati per la perfusione e pre-embedding immunocitochimica.
   - 1L del 4,0% paraformaldeide (PFA, pH 7,4) la soluzione fissativa, che consentirà la perfusione di 6 topi. A tal fine, riscaldare 1 litro di PB sotto una cappa aspirante. Pesare 40 g di granulare paraformaldeide (PFA) e versare la soluzione PB quando raggiunge i 60 ° C. Quando la soluzione è chiara, con la PFA completamente sciolto, raffreddare ....

Discussione

Qui abbiamo descritto un protocollo per la preparazione del tessuto cerebrale di topo microscopia immunoelectron che offre un ottimo compromesso tra ottimale conservazione ultrastrutturali e rilevamento immunocitochimica, quando le procedure sono rigorosamente eseguiti.

In combinazione con TEM, questo metodo consente di distinguere elementi cellulari con pochi tratti distintivi e dei criteri di identificazione. In particolare, il immunoperossidasi-DAB colorazione dei Iba1 consente di identif.......

Materiali

* Si deve sempre lavorare sotto una cappa aspirante e indossare guanti di nitrile quando si maneggiano acroleina, paraformaldeide e osmio e deve anche smaltire i propri rifiuti in modo corretto.