Preparazione dei campioni per la metabolomica: un metodo per preparare campioni cellulari per la profilazione dei metaboliti

Abstract

Fonte: Zhao, Y. C. et. al., Biologia dei sistemi di regolazione metabolica mediante segnalazione del recettore degli estrogeni nel cancro al seno. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video descrive una tecnica di preparazione di campioni di cellule di cancro al seno per la profilazione dei metaboliti. Le cellule del cancro al seno sono trattate con estradiolo, che si lega al recettore degli estrogeni alfa e provoca un cambiamento nella composizione del metabolita.

Protocol

1. Preparazione del campione per il saggio di metabolomica

1. Coltura cellulare e trattamento
   1. Seminare 400.000 cellule MCF7 per piastra da 10 cm in terreno di crescita. Per ogni trattamento preparare tre campioni. Utilizzare due piastre in ciascun campione per ricevere un numero sufficiente di cellule per il rilevamento. Il giorno 3, rimuovere il terreno e aggiungere 5 ml di terreno fresco con o senza ^10-8 M di estradiolo o E2 alle cellule. Trattare le celle per 24 ore (37 °C in atmosfera umidificata al 5% di CO₂
   ).
2. Raccolta campioni
   1. Aggiungere 5 ml di 1x PBS ghiacciato alla piastra, aspirare la PBS dopo aver inclinato brevemente la piastra più volte. Ripeti due volte e rimuovi quanta più PBS possibile dopo l'ultimo lavaggio.
   2. Aggiungere 750 μl di acetone pre-freddo a ciascuna piastra e raschiare le cellule. Unire le cellule in acetone da due piastre in un tubo da 2 ml su ghiaccio.
   3. Conteggio delle celle per la normalizzazione
      1. Per ogni trattamento, utilizzare due piastre extra per la quantificazione cellulare. Per staccare le cellule dalla piastra, aggiungere 2 ml di tampone HE (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO₃ e 1 mM EDTA) in ciascuna piastra e incubare per 5 minuti.
      2. Raccogliere e miscelare bene le cellule pipettando le cellule nel tampone HE. Utilizzare un totale di 20 μl di soluzione cellulare per contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
3. Conservare i campioni a -80 °C prima di inviarli al centro di metabolomica per identificare e quantificare i metaboliti utilizzando l'analisi della spettrometria di massa gascromatografica (GC-MS).