La rana Xenopus laevis Offre una interessante alternativa non-mammiferi modello per esplorare la possibilità di proteine da shock termico come gp96 per promuovere antigene-specifiche risposte delle cellule T CD8. Vi presentiamo i metodi per lo studio In vivo di cross-presentazione di antigeni tumorali della pelle e da gp96.
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Articolo metodologico
Comparativo In vivo Studio di gp96 Adjuvanticity nella rana Xenopus laevis
In questo articolo
Sommario
Abstract
Abbiamo sviluppato negli anfibi Xenopus laevis un unico non-mammiferi modello per studiare la capacità di alcune proteine da shock termico (HSP) come gp96 per facilitare la cross-presentazione di antigeni sorvegliati e suscitano innata e adattiva le risposte delle cellule T. Rigetto del trapianto pelle Xenopus fornisce una piattaforma eccellente per studiare la capacità di gp96 per suscitare classica MHC di classe Ia (classe Ia) limitato le risposte delle cellule T. Inoltre, il sistema Xenopus modello fornisce anche una valida alternativa al mouse per esplorare la capacità di gp96 di generare risposte contro i tumori che hanno down-regolato loro molecole di classe Ia fine di eludere la sorveglianza immunitaria. Recentemente, abbiamo sviluppato un saggio di trasferimento adottivo di cellule di cloni Xenopus utilizzando leucociti peritoneali come cellule presentanti l'antigene (APC), e dimostrato che la gp96 possibile preparare le risposte delle cellule T CD8 in vivo contro gli antigeni di istocompatibilità minori della pelle così come contro il tumore del timo Xenopus 15 / 0 che non esprime molecole di Ia classe. Descriviamo qui la metodologia coinvolti per eseguire questi test tra cui il trasferimento elicitazione, pulsante e adottivi dei leucociti peritoneali, così come l'innesto di pelle e saggi di trapianto di tumore. Inoltre siamo anche descrivendo la raccolta e la separazione dei leucociti del sangue periferico utilizzato per la citometria a flusso e saggi di proliferazione che consentono un'ulteriore caratterizzazione delle popolazioni effettrici coinvolte nel rifiuto della pelle e anti-tumore risposte.
Protocollo
1. Animali
X. laevis x X. Gilli ibridi LG-6 e LG-15 cloni isogenetic 1 sono dalla nostra colonia di riproduzione presso l'Università di Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 e LG-15 condividono lo stesso aplotipo MHC eterozigote (a / c) ma si differenziano a minori di istocompatibilità (H) loci. Progenie di questi cloni sono prodotti da gynogenesis, in cui le uova diploidi prodotte dalla femmina sono attivati da UV-irradiati spermatozoi (nessun contributo del DNA per la progenie).
L'uso di guanti è facoltativo. Alcune persone preferiscono non li ....
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Discussione
L'anfibio Xenopus è un unico versatile non mammiferi modello per studiare l'immunità. Il suo largo uso nella ricerca biomedica e immunologico ha prodotto in molti strumenti di ricerca importanti come i cloni MHC definito LG-6 e LG-15 così come diverse linee cellulari e anticorpi monoclonali. L'utilizzo di questi strumenti che abbiamo stabilito diversi in vitro e in vivo per studiare la capacità delle proteine heat shock come gp96 di mediare potente Ag-specifici anti-minori H-Ag e.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
La zootecnia esperto fornito da Tina Martin e David Albright è apprezzati. Questa ricerca è stata sostenuta da finanziamenti T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 dal NIH.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti necessari: | |||
| Soluzione salina tamponata al fosfato per anfibi (APBS): | |||
| NaCl, 1,15 g/L | |||
| Na2HPO4, 0,2 g/L | |||
| KH2PO | |||
| NaOH 10 N | |||
| Tricaina metanosolfonato (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | |
| Bicarbonato di sodio | Fisher Scientific | S-233-500 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100 ml |
| Sale sodico di eparina | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Mezzo di coltura per tumori Xenopus 15/0 [vedi 3 per maggiori dettagli]: | |||
| Mezzo basale Iscove DMEM | GIBCO, di Life Technologies | 11965 | |
| Insulina | |||
| Aminoacidi non essenziali | |||
| Penicillina-streptomicina | |||
| Kanamicina | |||
| Primatone | Divisione Prodotti Sheffield | ||
| β2-mercaptoetanolo–etanolo | |||
| NaHCO3 | |||
| 30% acqua doppia distillata | |||
| 5% di siero fetale bovino | |||
| 20% di supernatante da una linea cellulare renale di Xenopus A6 | |||
| 0,25% di siero normale di Xenopus | |||
| Materiali e attrezzature: | |||
| Tubi conici sterili per centrifuga da 50 e 15 ml | |||
| Aghi sterili Precision Glide da 25 gauge, 5/8 | BD Biosciences | ||
| 18 gauge 1½ Aghi sterili Precision Glide | BD Biosciences | ||
| Siringa sterile da 1 ml con ago fisso per tubercolina | BD Biosciences | ||
| Siringa sterile da 10 ml con estremità liscia | BD Biosciences | ||
| Tubi microcentrifuga da 1,5 ml (sterili) | |||
| Piatti di Petri in polistirene 60 x 15 mm sterili | Falcon BD | ||
| Lame da rasoio | |||
| Vetrini microscopici premium 25 X 75 mm X 1 mm | Fisher Scientific | ||
| Pietre di Petri in vetro da 10 cm | |||
| 9" Pipette Pasteur in vetro borosilicato Durex, monouso, con tappo di cotone | VWR international | ||
| Tubazione Tygon | |||
| Due pinzette di tipo 5 svizzere’s Pinze | Miltex Inc. | ||
| Forbici da dissezione microchirurgiche McPherson-Vannas con bordo tagliente dritto, 6 mm | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| calibri Helios | |||
| Microscopio stereoscopico | |||
| Illuminatore ad alta intensità | |||
| Ematocitometro | |||
| Un-bunsen burner | |||
| 37°incubatore con agitazione | |||
| Centrifuga |
Riferimenti
- Kobel, H. R., Pasquier, D. u, L, Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus. Nature. 279, 157-158 (1979).
- Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the....
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Ristampe e permessi
