Comparativo In vivo Studio di gp96 Adjuvanticity nella rana Xenopus laevis</em

Sommario

La rana Xenopus laevis Offre una interessante alternativa non-mammiferi modello per esplorare la possibilità di proteine ​​da shock termico come gp96 per promuovere antigene-specifiche risposte delle cellule T CD8. Vi presentiamo i metodi per lo studio In vivo di cross-presentazione di antigeni tumorali della pelle e da gp96.

Abstract

Abbiamo sviluppato negli anfibi Xenopus laevis un unico non-mammiferi modello per studiare la capacità di alcune proteine ​​da shock termico (HSP) come gp96 per facilitare la cross-presentazione di antigeni sorvegliati e suscitano innata e adattiva le risposte delle cellule T. Rigetto del trapianto pelle Xenopus fornisce una piattaforma eccellente per studiare la capacità di gp96 per suscitare classica MHC di classe Ia (classe Ia) limitato le risposte delle cellule T. Inoltre, il sistema Xenopus modello fornisce anche una valida alternativa al mouse per esplorare la capacità di gp96 di generare risposte contro i tumori che hanno down-regolato loro molecole di classe Ia fine di eludere la sorveglianza immunitaria. Recentemente, abbiamo sviluppato un saggio di trasferimento adottivo di cellule di cloni Xenopus utilizzando leucociti peritoneali come cellule presentanti l'antigene (APC), e dimostrato che la gp96 possibile preparare le risposte delle cellule T CD8 in vivo contro gli antigeni di istocompatibilità minori della pelle così come contro il tumore del timo Xenopus 15 / 0 che non esprime molecole di Ia classe. Descriviamo qui la metodologia coinvolti per eseguire questi test tra cui il trasferimento elicitazione, pulsante e adottivi dei leucociti peritoneali, così come l'innesto di pelle e saggi di trapianto di tumore. Inoltre siamo anche descrivendo la raccolta e la separazione dei leucociti del sangue periferico utilizzato per la citometria a flusso e saggi di proliferazione che consentono un'ulteriore caratterizzazione delle popolazioni effettrici coinvolte nel rifiuto della pelle e anti-tumore risposte.

Protocollo

1. Animali

X. laevis x X. Gilli ibridi LG-6 e LG-15 cloni isogenetic ¹ sono dalla nostra colonia di riproduzione presso l'Università di Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 e LG-15 condividono lo stesso aplotipo MHC eterozigote (a / c) ma si differenziano a minori di istocompatibilità (H) loci. Progenie di questi cloni sono prodotti da gynogenesis, in cui le uova diploidi prodotte dalla femmina sono attivati ​​da UV-irradiati spermatozoi (nessun contributo del DNA per la progenie).

L'uso di guanti è facoltativo. Alcune persone preferiscono non li indossano perché è più difficile da maneggiare le rane (scivoloso) e in effetti sembra di fare le rane a disagio.

2. Purificazione di gp96 da 15 / 0 tumorale (Tumor ed esprime sia minore H-Ags)

Gp96 purificazione è stato descritto in precedenza ^{2, 3.} In breve, gp96 è purificato dal frazionamento solfato di ammonio 50-70%, seguita da Ancona-sefarosio e DEAE cromatografia. Circa 20-50 mg di proteina possono essere ottenuti per 1 ml di tessuto tumorale. La purezza del preparato è determinata dalla SDS-PAGE e colorazione argento.

3. Elicitazione e Harvest di leucociti peritoneale (PL) dalla minore H-Ag-disparati LG-6 Rane

1. Crescere un 25 mL notte E. Cultura Coli in un tubo da 50 ml conici a 37 ° C con agitazione.
2. Il calore giorno successivo uccidere i batteri da bollire per 1 ora.
3. Centrifugare il caldo ha ucciso E. Coli per 15 min a 2.000 giri (1.500 g) a 4 ° C.
4. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet batterico in 1 / 10 ^° volume cultura originale (2,5 ml) in APBS. A questo punto la coltura batterica è pronto per l'uso e deve essere utilizzato entro 24 ore.
5. Iniettare intraperitoneale (ip) 200 (per una rana 2 pollici) o 300 ml (per una rana 3 pollici) del calore uccisi per la preparazione batterica rana con un calibro 25 5 / 8 ago.
6. Tre giorni dopo l'iniezione PL vengono raccolte a lavaggio intraperitoneale.
7. Prima della raccolta PL, rane adulte sono anestetizzati per immersione in una soluzione acquosa 0,1% di metano solfonato tricaine (TMS, MS-222) tamponato con bicarbonato di sodio per un massimo di 5 minuti fino a quando tutti i movimenti cessa (la durata dipende dalla dimensione ed età). Animali scia entro 10-20 minuti dopo il trattamento.
8. Disinfettare l'addome della rana con una piccola quantità di etanolo al 70%.
9. Iniettare 5 ml (per una rana 2 pollici) o 10 ml (per una rana 3 pollici) di APBS sterile pre-riscaldato a temperatura ambiente nella cavità peritoneale con una calibro 18 1 ½ ago. Rimuovere l'ago e massaggiare delicatamente la rana per un minuto per assicurarsi che il buffer iniettato in equilibrio con il liquido nella cavità del corpo.
10. Utilizzare un nuovo 18 gauge 1 ½ una siringa senza ago per raccogliere il liquido peritoneale, che a goccia dalla parte posteriore dell'ago in un ambiente pulito tubo da 50 ml. Assicurati di recuperare la maggior quantità di volume iniziale iniettato possibile. Stare attenti ad evitare i vasi sanguigni nella zona centrale della regione addominale.
11. Una volta PL vengono raccolte mettere la rana in un contenitore con acqua bassa fino a quando è sveglio a quel punto può essere rimesso nella sua gabbia.

4. Trasferimento pulsare e adottivi del Lg-6 Pls Into Naive Lg-6 Destinatari

1. Lavare la PL volta con APBS freddo e centrifugare li a 1.000 giri (750 g) per 10 minuti a 4 ° C.
2. Rimuovere il supernatante e risospendere il PL in APBS.
3. Il polso del PL con gp96 ad una concentrazione di 1 mg gp96 per 5 x 10 ⁵ PL.
4. Una volta che la quantità appropriata di gp96 viene aggiunto al PL, mescolarli pipeting e incubare in ghiaccio per 1 ora.
5. Centrifugare le cellule sia a 1000 rpm per 10 min a 4 ° C o a 14.000 rpm per 1 min di togliere qualunque legato gp96.
6. Lavare la PL 3X con APBS fredda per assicurare che non residuale gp96 sinistra.
7. Risospendere il PL pulsata ad una concentrazione di 5 x 10 ⁵ PL per 300 ml.
8. Adoptively trasferimento PL mediante iniezione ip utilizzando calibro 25 5 / 8 ago. Iniettare 300 ul di PL pulsata (5 x 10 ⁵ cellule) per animale.
9. Le rane dovranno essere innescato almeno 3 giorni prima di continuare con innesto di pelle o esperimenti sfida tumore.

5. Innesto della pelle Assay

Il rigetto del trapianto della pelle è una realtà consolidata nel saggio Xenopus ^{4, 5, 6.} In Xenopus, un destinatario rifiuta la pelle del donatore visualizzazione di 1 o 2 mismatch aplotipo MHC entro 18-22 giorni a 21-22 ° C. Al contrario, i trapianti di pelle tra LG e LG-6-15 cloni che differiscono solo per piccoli H-Ags vengono respinte più lentamente (più di 30 giorni). Tuttavia, questo rifiuto è accelerata nei pazienti that sono stati vaccinati contro il donatore minore H-Ags sia da un innesto di pelle precedente o tramite l'immunizzazione con gp96 purificata dal donatore. Nessun rifiuto a tutti si verifica quando il donatore e il ricevente sono geneticamente identici (ad esempio, gli animali clonati o completamente inbred). Pertanto, questa semplice tecnica è molto potente per la caratterizzazione in vivo risposte immunitarie provocato da gp96.

1. Anestetizzare rana donatore, come descritto in 3.7.
   Nota: solo le precauzioni minime devono essere prese dal Xenopus produrre potente anti-microbico peptidi (ad esempio, magainin) nella pelle che elimina la necessità per un totale di procedure asettiche. Infatti, il trattamento della rana con qualsiasi disinfettante sarebbe dannoso per la pelle. Inoltre, Xenopus non hanno alcun agenti patogeni che possono essere trasferiti agli esseri umani. Pertanto, l'uso di guanti è facoltativo. Tuttavia, tutti gli strumenti di dissezione utilizzati devono essere sterilizzati in autoclave e tutte le soluzioni devono essere sterili.
2. Tagliare e rimuovere una piccola (20 mm x 5 mm) pezzo di pelle ventrale (cute addominale che sembra argentato per la presenza di irridophore cellule pigmentate) da un LG-15 rana donatore con le forbici.
3. Posizionare la pelle in un APBS Petridish contenimento e tenerlo in ghiaccio. Manipolare il tessuto della pelle molto delicatamente, evitare di tenere in tra le pinze.
4. Utilizzando un rasoio o le forbici tagliare i singoli innesti in 5 mm x 5 pezzi mm. Tenere i frammenti in APBS sul ghiaccio.
5. A questo punto la rana donatore viene inserito in un contenitore con acqua bassa fino a quando è sveglio e poi viene messo in acqua contenenti antibiotici (Penstrep a una concentrazione di 5 mg / L). La rana è tenuto in acqua con gli antibiotici per due giorni ea quel punto si ritorna in acqua normale. La piccola ferita nel sito in cui è stata rimossa la pelle non ha bisogno di essere cucite e guarisce entro una settimana.
6. Anestetizzare l'LG-6 destinatario rana.
7. Fai una piccola incisione sulla dorsale (posteriore) della pelle del destinatario e inserire il 5 mm x 5 innesto mm sotto la pelle con la parte argentea alto. Fare attenzione a non introdurre bolle d'aria di grandi dimensioni sotto la pelle perché può portare allo spostamento o addirittura la perdita del trapianto.
8. Assicurati di notare le marcature forbici e pinze sul innesti, perché quelli non sono conteggiati come rigetto una volta che il punteggio comincia.
9. 24 ore più tardi una parte della pelle ospitare sovrapposizione deve essere rimosso dal trapianto.
10. Anestetizzare l'LG-6 destinatario rana. Gestire l'animale, come descritto al punto 5.1.
11. Utilizzando le forbici autoclave ritagliare una finestra intorno al trapianto in modo che l'innesto può essere liberamente visualizzati. Fare attenzione a non toccare la pelle del donatore o di indurre emorragie. Lasciate che la rana di recuperare, come descritto in 5.5.
12. Avviare segnando l'innesto subito facendo uno schizzo. Il rigetto del trapianto cutaneo è determinato dalla percentuale di distruzione del irridophores sulla pelle innestata.
13. Gli innesti devono essere controllati ogni 2-3 giorni, ma gli animali non hanno bisogno di essere anestetizzati per questo. Per visualizzare gli innesti, le rane devono essere collocati in un petridish sotto un microscopio da dissezione.

6. Tutto-mount Immunohistology di pelle trapiantato

Rana con tutto il montaggio immunohistology è stato descritto in precedenza ^6. In breve, la rana è anestetizzato e posto sotto il microscopio su un tovagliolo di carta sterile pre-bagnato con acqua rana (l'area di lavoro è anche asetticamente preparato). La pelle viene poi trapiantato raccolte insieme ad una piccola quantità di cute circostante ospite e si è macchiato con anticorpi in modo simile a colorazione delle cellule per l'analisi di citometria a flusso ^6. Strumenti in autoclave e tamponi sterili devono essere utilizzati. Dopo la colorazione della pelle è posto su un vetrino da microscopio e delicatamente pressato con una scivolata di copertura. A questo punto la pelle può essere visualizzato usando un microscopio a fluorescenza per diverse popolazioni cellulari che hanno infiltrato l'innesto. Al termine della procedura la rana è tenuto in acqua con gli antibiotici come descritto nella sezione 5.5. ed è tornato in acqua normale. La piccola ferita sinistra dove la pelle è stato rimosso guarisce entro una settimana.

7. Caratterizzazione dei leucociti del sangue

1. Prima di togliere il sangue dalla rana, si ha la necessità di preparare "aghi di vetro" tirando sterile pipette Pasteur a fuoco. L'estremità sottile della pipetta è acuito con lo stereomicroscopio. La pipetta viene poi collegato ad un tubo di plastica aspirazione.
   Tutti gli strumenti come le pinze e le forbici devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'uso.
2. Anche preparare ghiacciata 10 ml di soluzione di eparina APBS e con l'aggiunta di 50 unità di eparina per 1 ml di APBS. Tenere la soluzione su ghiaccio. Tutte le soluzioni utilizzate devono essere sterili.
3. Anestetizzare rana come descritto in 3.7, e seguire le stesse procedure di trattamento degli animali, come descritto al punto 5.1. .
4. Tagliare la pelle sopra il piede posteriore per esporrela vena dorsale tarso.
5. Riempire la pipetta Pasteur con 1-2 mL di soluzione APBS + eparina.
6. Inserire la "ago di vetro" nella vena e iniziare a raccogliere il sangue lentamente aspirando con la bocca. E 'importante avere APBS soluzione di eparina + nel "ago di vetro" in quanto questo impedisce la coagulazione del sangue e intasamento sulla punta dell'ago.
7. 1 a 2 ml di sangue può essere ottenuto da una rana di medie dimensioni.
8. La piccola incisione sulla gamba della rana non ha bisogno di essere cucito e la ferita guarisce entro una settimana.
9. Centrifugare il sangue a 1.000 rpm per 10 minuti a 4 ° C.
10. Rimuovere il supernatante e lavare le cellule 1X con 10 ml di APBS freddo.
11. Sovrapposizione 2 ml di sangue (1-5 x 10 ⁶ celle) su 1 ml di Ficoll HISTOPAQUE 1,077 (Sigma), pre-riscaldato a temperatura ambiente al fine di separare i leucociti del sangue dai globuli rossi.
12. Centrifugare 20 min a 1.000 giri al minuto a temperatura ambiente, senza freno, e raccogliere quindi la banda dei leucociti.
13. Lavare le cellule 2X con APBS per centrifugazione a 1.400 rpm per 10 minuti a 4 ° C per rimuovere i residui di Ficoll.
14. A questo punto le cellule sono pronte per essere colorate con anticorpi per l'analisi di citometria a flusso, o da utilizzare per il test in coltura in vitro.

8. Tumore Trapianto di analisi

1. Circa una settimana prima del disgelo esperimento in un lotto fresco di cellule 15 / 0 tumore e fare in modo che le cellule iniziano a crescere bene. Terreno di coltura è succintamente descritto nella sezione successiva e più in dettaglio in ^3.
2. Espandere il 15 / 0 cellule tumorali.
3. Il giorno dell'esperimento, contare le cellule e determina morte cellulare per esclusione tripan blu. La morte cellulare deve essere inferiore al 5%. Lavare le cellule 1X a APBS freddo, e centrifugare a 1.000 rpm a 4 ° C per 10 min.
4. Risospendere le cellule in terreno di coltura del tumore ad una densità di 5 x 10 ⁵ 15 / 0 cellule per 300 ml.
5. Trapianto di 5 x 10 ⁵ cellule in 300 microlitri di volume per rana per iniezione sottocutanea con un calibro 25 5 / 8 ago su un lato della dorsale (posteriore) lato dell'animale.
6. La crescita del tumore avrà inizio entro 2-3 settimane dopo la sfida del tumore. La comparsa del tumore iniziale deve essere notato e il volume del tumore deve essere registrato ogni 2-3 giorni. Volume del tumore (altezza x larghezza x lunghezza) è misurata con le pinze.
7. Una volta che il tumore cresce a 3.500 mm ³ o la rana inizia a guardare letargico, ha bisogno di essere l'eutanasia per evitare disagi.

9. Reagenti necessari:

• Anfibio soluzione tampone fosfato (APBS): 6,6 g / L di NaCl, 1,15 g / L di Na ₂ HPO _4, 0,2 g / l KH ₂ PO. il pH a 7,5 con NaOH 10N e filtro sterilizzato attraverso filtro 0,2 micron.
• Tricaine solfonato metano (TMS, MS-222) (Crescent ricerca CAS # 886-86-2 sostanze chimiche).
• Bicarbonato di sodio (Fisher Scientific S-233-500).
• HISTOPAQUE-1077 (Sigma-Aldrich 10771-100 ml)
• Eparina sale di sodio (Sigma-Aldrich H3149-50KU)
• Terreno di coltura per Xenopus 15 / 0 tumori [vedi 3 per ulteriori dettagli]: 1 l di media basale Iscove DMEM (Invitrogen Gibco-11965) con 10 Insulina ml, 10 ml aminoacidi non essenziali, 10 mL di penicillina-streptomicina; 10 mcg / ml di kanamicina, 3 mL di primatone (Sheffield Products Division), 1 ml di β2-mercaptoetanolo, e 3,02 g di NaHCO ₃ in acqua (pH 7,0). Questo mezzo è diluito a osmolarità anfibi con l'aggiunta di 30% di acqua bidistillata ed integrata con 5% di siero fetale bovino, il 20% superantant da una A6 linea di Xenopus cellule renali, e lo 0,25% del normale Xenopus siero.

10. Rappresentante Risultati

Figura 1. Analisi stereomicroscopio di rigetto del trapianto cutaneo 12 giorni dopo il trapianto. LG-6 rana clonato ricevuto un trapianto di pelle da entrambi (A) un MHC-identico LG-6 (non mostra alcun rifiuto) o (B) un MHC-disparati donatori consanguinei (80% rifiuto). Le frecce indicano le cellule pigmentate iridophore argenteo marcatura sani (non respinte) del tessuto innestato. (*) Mark of non forcipe a causa di rifiuto.

Figura 2. Gp96 facilita la cross-presentazione di antigeni tumorali in Xenopus. LG PL-15 (5 x 10 ⁵⁾ sono stati pulsata per 1 ora su ghiaccio sia con APBS (controllo negativo), 1 mg di gp96 ricombinante purificata da E. Mcg cultura Coli, o 1 o 0,5 di gp96 purificata da 15 / 0 tessuto tumorale. Dopo 3 lavaggi, le cellule sono state trasferite in adoptively LG-15 pazienti adulti (1 x 10 ⁶ / individuale). Tre giorni dopo, dal vivo 15 / 0 cellule tumorali (5 x 10 ⁵⁾ sono statitrapiantati per iniezione sottocutanea. Ogni curva rappresenta la cinetica della crescita tumorale in una rana. Giorni dopo sfida, quando i tumori sono stati monitorati prima apparizione, e la dimensione del tumore è stata determinata periodicamente con un (lunghezza x larghezza x spessore) pinza.

Discussione

L'anfibio Xenopus è un unico versatile non mammiferi modello per studiare l'immunità. Il suo largo uso nella ricerca biomedica e immunologico ha prodotto in molti strumenti di ricerca importanti come i cloni MHC definito LG-6 e LG-15 così come diverse linee cellulari e anticorpi monoclonali. L'utilizzo di questi strumenti che abbiamo stabilito diversi in vitro e in vivo per studiare la capacità delle proteine ​​heat shock come gp96 di mediare potente Ag-specifici anti-minori H-Ag e...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti necessari:
Soluzione salina tamponata al fosfato per anfibi (APBS):
NaCl, 1,15 g/L
Na2HPO4, 0,2 g/L
KH2PO
NaOH 10 N
Tricaina metanosolfonato (TMS, MS-222)	Crescent Research Chemicals	CAS#886-86-2
Bicarbonato di sodio	Fisher Scientific	S-233-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	100 ml
Sale sodico di eparina	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Mezzo di coltura per tumori Xenopus 15/0 [vedi 3 per maggiori dettagli]:
Mezzo basale Iscove DMEM	GIBCO, di Life Technologies	11965
Insulina
Aminoacidi non essenziali
Penicillina-streptomicina
Kanamicina
Primatone	Divisione Prodotti Sheffield
β2-mercaptoetanolo–etanolo
NaHCO3
30% acqua doppia distillata
5% di siero fetale bovino
20% di supernatante da una linea cellulare renale di Xenopus A6
0,25% di siero normale di Xenopus
Materiali e attrezzature:
Tubi conici sterili per centrifuga da 50 e 15 ml
Aghi sterili Precision Glide da 25 gauge, 5/8	BD Biosciences
18 gauge 1½ Aghi sterili Precision Glide	BD Biosciences
Siringa sterile da 1 ml con ago fisso per tubercolina	BD Biosciences
Siringa sterile da 10 ml con estremità liscia	BD Biosciences
Tubi microcentrifuga da 1,5 ml (sterili)
Piatti di Petri in polistirene 60 x 15 mm sterili	Falcon BD
Lame da rasoio
Vetrini microscopici premium 25 X 75 mm X 1 mm	Fisher Scientific
Pietre di Petri in vetro da 10 cm
9" Pipette Pasteur in vetro borosilicato Durex, monouso, con tappo di cotone	VWR international
Tubazione Tygon
Due pinzette di tipo 5 svizzere’s Pinze	Miltex Inc.
Forbici da dissezione microchirurgiche McPherson-Vannas con bordo tagliente dritto, 6 mm	Roboz Surgical Instruments Co.
calibri Helios
Microscopio stereoscopico
Illuminatore ad alta intensità
Ematocitometro
Un-bunsen burner
37°incubatore con agitazione
Centrifuga