Saggio della fosfatasi nelle cellule CRC: un metodo per esaminare lo stato di fosforilazione della proteina tau nelle cellule tumorali del colon-retto

Abstract

Fonte: Huda, M. N., et al. test per la fosforilazione e il legame dei microtubuli insieme alla localizzazione della proteina tau nelle cellule tumorali del colon-retto. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video descrive un protocollo per valutare lo stato di fosforilazione della proteina tau mediante un test della fosfatasi nelle cellule tumorali del colon-retto. L'enzima fosfatasi agisce sui gruppi fosfato presenti sulla proteina tau, aumentando la mobilità della proteina tau sul gel SDS PAGE rispetto ai campioni di proteina tau non trattati.

Protocollo

1. Dosaggio della fosfatasi

1. Trattare i lisati cellulari quando le cellule raggiungono una confluenza di ~65% (approssimata al microscopio), rimuovere il terreno integrato con MEM e aggiungere MEM privo di siero con 5 μM, 10 μM e 30 μM di curcumina o 25 mM, 50 mM e 100 mM di LiCl. Incubare a 37 °C per 24 ore in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂, 24 ore dopo il trattamento, lavare le cellule con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) e raschiare le cellule con un raschietto cellulare. Trasferire le cellule raschiate in provette da centrifuga da 1,5 mL e centrifugare per 4 minuti a 1.800 x g a 4 °C per ottenere pellet di cellule. Limare le celle sospendendo i pellet in 100 μl di tampone RIPA completo a 4 °C per 20 minuti picchiettando regolarmente le provette. Sonicare brevemente i campioni. Centrifugare gli omogeneigenati cellulari in una centrifuga da banco a 22.570 x g per 20 minuti a 4 °C. Trasferire i surnatanti in altre provette marcate utilizzando una pipetta) con fosfatasi alcalina nel tampone fosfatasi alcalina.
   1. Sia per i campioni di controllo che per quelli trattati, preparare campioni da 20 μl contenenti 20 μg di proteine totali. Aggiungere il volume di lisati cellulari che contiene 20 μg di proteine totali, seguito da 2 μL di tampone fosfatasi alcalina e 10 μL di fosfatasi alcalina. Aggiungere acqua distillata fino a ottenere 20 μl.
2. Incubare i campioni a 37 °C per 1 ora. Arrestare la reazione aggiungendo acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) a una concentrazione finale di 50 mM, o aggiungendo ortovanadato di sodio (Na₃VO₄) a una concentrazione finale di 10 mM. La reazione può essere interrotta anche riscaldando a 75 °C per 5 minuti.
3. Prima di terminare l'incubazione dei campioni con fosfatasi, preparare campioni della stessa concentrazione senza aggiungere fosfatasi per il confronto con campioni trattati con fosfatasi.
4. Aggiungere il tampone di caricamento del gel SDS 4X appena preparato contenente 400 mM DTT.
5. Incubare i campioni su un blocco termico a 100 °C per 5 minuti. Mescolare i campioni utilizzando un vortice. Raffreddare a temperatura ambiente per ~10-15 min.
6. Assemblare un sistema di elettroforesi per l'esecuzione di un gel di poliacrilammide al 10% di SDS-PAGE.
   1. Caricare 10 μg di proteine (13 μL di campione) per pozzetto su un gel di poliacrilammide al 10%. Caricare la scala a graduatoria.
   2. Dopo aver caricato il campione, collegare gli elettrodi positivo e negativo del sistema di elettroforesi a una fonte di alimentazione per mantenere una tensione costante. Inizialmente, iniziare a 70 V per 20 minuti per spostare i campioni di proteine dal gel di impilamento al gel risolutivo. Quindi, aumentare la tensione a 125 V e far funzionare il gel per circa 70-120 minuti fino a quando i campioni e la scala proteica raggiungono la fine del gel.
   3. Dopo il completamento dell'elettroforesi, trasferire il gel su una membrana in PVDF utilizzando un sistema di elettroblotting a umido. Trasferimento per ~100 min a 100 V.
   4. Segna la macchia praticando un piccolo taglio sul lato della scala del peso molecolare. Utilizzare un foglio di plastica trasparente e un taglierino affilato per tagliare la macchia.
7. Bloccare la membrana in un tampone bloccante BSA al 4% per 90 minuti a temperatura ambiente.
8. Incubare il blot in soluzione di anticorpi primari (anti-tau a 1:5.000) a 4 °C per una notte. Lavare la macchia in PBST quattro volte, per 7 minuti ciascuna.
9. Preparare la soluzione di anticorpi secondari pertinente (IgG di capra anti-topo a 1:5.000) e incubare il blot per 90 minuti a temperatura ambiente. Lavare in PBST quattro volte, per 7 minuti ciascuna.
10. Sviluppare il blot utilizzando un kit di chemiluminescenza secondo le raccomandazioni del produttore. Coprite la macchia con pellicola trasparente. Acquisizione di immagini mediante un sistema di imaging a chemiluminescenza per la chemiluminescenza con il software pertinente.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cella HCT 116	ATCC	CCL-247
Piatto da 100 mm	Corning	430161
MEM (EBSS)	Clone	SH30024.01
Siero fetale bovino (FBS)	ThermoFisher (Gibco)	16000044	Conservare a -20 °C
Anticorpo anti-Tau 13	Abcam	ab19030
Ditiotreitolo (DTT)	Roche	10 708 984 001	Temperatura di stoccaggio 2–8 °C
curcumina	Sigma-Aldrich (Fluka)	Codice: 78246	Temperatura di stoccaggio 2–8 °C
Anticorpo anti-Tau (fosfo S396)	abcam	ab109390
FastAP Fosfatasi alcalina termosensibile	Termo Scientifico	EF0651	Conservare a -20 °C
PMSF	sigma	P7626	Conservare a temperatura ambiente
Cocktail di inibitori della fosfatasi	Segnalazione cellulare	Codice: 5870	Conservare a 4 °C
Cocktail di inibitori della proteasi	Segnalazione cellulare	Codice: 5871	Conservare a 4 °C
Anticorpo secondario IgG anti-topo di capra	ThermoFisher	A-11005	Conservare a 4 °C al buio
Sodio Dodecil Solfato (SDS)	Affymetrix	Codice: 75819
Imager molecolare	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	Conservare a 4 °C
Tampone RIPA	sigma	R 0278	Temperatura di stoccaggio 2–8 °C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X - 100	Conservare a circa 25 °C
membrana in PVDF	Bio-Rad	Codice 162-0177
Anticorpo secondario IgG anti-topo di capra	ThermoFisher	A-11005	Conservare a 4 °C al buio
Sodio Dodecil Solfato (SDS)	Affymetrix	Codice: 75819
Reagente colorante per saggi proteici	Bio-Rad	500-0006
Sonic Dismembrator	Fisher Scientifico	Modello 500
Centrifughe per microlitri	Hettich Zentrifügen	MIKRO 200 R