Toxoplasma gondii converte in una forma cisti in risposta a stress ambientali, che può essere imitato in modelli di colture di tessuti. Questo video mostra le tecniche per esaminare la formazione di cisti muro attivando midollo osseo macrofagi o modificare il pH medio di crescita in cellule di fibroblasti.
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Articolo metodologico
Toxoplasma gondii parete formazione di cisti in attivo dal midollo osseo macrofagi e condizioni Bradyzoite
In questo articolo
Sommario
Abstract
Toxoplasma gondii è un parassita intracellulare obbligato che possono infettare ogni cellula nucleata di animali a sangue caldo. Durante l'infezione, T. gondii diffonde come una forma veloce replicando chiamato tachizoite. Tachizoiti convertire in una lenta crescita forma incistata chiamato bradyzoite da un processo di segnalazione che non è ben caratterizzato. All'interno di animali, cisti bradyzoite si trovano nel sistema nervoso centrale e del tessuto muscolare e rappresentano la fase cronica di infezione. Conversione in bradyzoites può essere simulato in coltura da CO 2 fame, utilizzando medio alta con un pH, o l'aggiunta di interferone gamma (IFNγ). Bradyzoites sono caratterizzate dalla presenza di un muro di cisti, a cui la lectina Dolichos biflorus agglutinina (DBA) si lega. DBA fluorescente viene utilizzato per visualizzare le cisti di parassiti muro cresciuto in fibroblasti umani prepuzio (HFFS) che sono stati esposti a basse emissioni di CO 2 e medio alto pH. Allo stesso modo, i parassiti che risiedono nel midollo osseo murino di derivazione macrofagi (BMMs) visualizzare una parete cisti rilevabile dal DBA dopo la BMMs sono attivate con IFNγ e lipopolisaccaride (LPS). Questo protocollo verrà illustrato come indurre la conversione di T. gondii a bradyzoites utilizzando un mezzo di crescita elevati pH con 2 CO bassa e l'attivazione di BMMs. Cellule ospiti saranno coltivati su vetrini, infettati con tachizoiti e sia attivato con aggiunta di IFNγ e LPS (BMMs) o esposti a una media di crescita elevato pH (HFFS) per tre giorni. Al termine delle infezioni, cellule ospiti sarà fissato, permeabilizzate, e bloccato. Pareti cisti verrà visualizzato usando DBA rodamina con microscopia a fluorescenza.
Protocollo
1. Preparazione dei fibroblasti prepuzio umano (HFF) rivestite coprioggetto
- Mettere un coprioggetti sterile di vetro rotonda sul fondo dei pozzetti di una 24-pozzetti di coltura tissutale.
- Per raccogliere HFFS da un confluente 150 centimetri 2 fiasco, lavare il pallone due volte con PBS 1X e aggiungere 2,5 ml di 0,025% tripsina-EDTA. Incubare Pallone a 37 ° C per 5-10 minuti.
- Toccando il lato del pallone contro il palmo della mano può aiutare a staccare le cellule dal pallone. Una volta che le cellule hanno liberato dal pallone, aggiungere 150 ml di HFF media (Dulbecco Modified Aquila Media [DMEM] con 10% FBS, 2 mM L-glutamin....
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Discussione
Mentre il meccanismo di sviluppo bradyzoite non è pienamente compreso, analisi di genetica molecolare di T. stadio di conversione gondii in colture di tessuti ha portato alla scoperta di geni che sono coinvolti nella formazione di cisti bradyzoite 2,3,4. Le analisi inoltre ha portato alla constatazione che alcuni marcatori bradyzoite sono espressi in altre condizioni di stress prolungato, tra cui la crescita in macrofagi attivati 5,6. I metodi sopra descrivono come far crescere .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla University of Wisconsin-Madison Herman I. Shapiro Distinguished Graduate Fellowship (CMT), premio NIH AI072817 (AMP) e dell'American Heart Association Award 0840059N (LJK).....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Mezzo Dulbecco’s Modified Eagle (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | inattivare al calore |
| Rodamina Dolichos biflorus agglutinina | Vector Laboratories | RL-1032 | |
| Formaldeide (16%) | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Glicina | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| IFNγ | PeproTech Inc | 315-05 | Conservare in aliquote monouso |
| L-glutammina (200 mM) | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Lipopolisaccaride (LPS) | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Conservare in aliquote monouso |
| Vetrini coprioggetto per microscopio | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| Penicillina-Streptomicina | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Mezzo RPMI 1640 in polvere (con L-glutammina, senza bicarbonato) | GIBCO, by Life Technologies | 31800-022 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| Mezzo di montaggio VectaShield con DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
Riferimenti
- Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
- Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S.
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Ristampe e permessi
