Per lo sviluppo di RNA interference (RNAi) a base di terapie, una nuova strategia è stata sviluppata, transkingdom RNAi (tkRNAi). Questa tecnologia utilizza batteri non patogeni per produrre e consegnare terapeutici a breve hairpin RNA (shRNA) all'interno delle cellule bersaglio. Qui, tkRNAi stato applicato con successo per l'inversione del classico ABCB1-mediata multiresistenza ai farmaci (MDR) delle cellule tumorali.
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Articolo metodologico
Consegna batterica di RNAi per DJ: Transkingdom RNAi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Interferenza dell'RNA (RNAi) rappresenta un meccanismo efficace per alto inibizione specifica di espressione di mRNA. Oltre alla sua potenzialità come strumento di laboratorio potente, il percorso RNAi sembra essere promettente per l'utilizzo terapeutico. Per lo sviluppo di RNA interference (RNAi) a base di terapie, la consegna di RNAi-mediare agli agenti di cellule bersaglio è uno dei principali ostacoli. Una nuova strategia per superare questo ostacolo è transkingdom RNAi (tk RNAi). Questa tecnologia utilizza batteri non patogeni, ad esempio, Escherichia coli, a produrre e consegnare terapeutici a breve hairpin RNA (shRNA) all'interno delle cellule bersaglio per indurre RNAi. Una prima generazione tk RNAi-mediare vettore, TRIP, contiene il promotore del batteriofago T7 per la regolazione della espressione di un shRNA terapeutiche di interesse. Inoltre, TRIP è il luogo Inv. da pseudotuberculosis Yersinia che codifica invasin, che permette di batteri naturali non invasivi per entrare β1-integrina-positivi cellule di mammifero e il gene HlyA da Listeria monocytogenes, che produce listeriolysin O. Questo enzima permette la shRNA terapeutico per sfuggire ingresso vescicole all'interno del citoplasma della cellula bersaglio. Costruisce TRIP sono introdotti in un competente non patogeni ceppo di Escherichia coli, che codifica per l'RNA polimerasi T7 necessari per il promotore T7-driven sintesi di shRNAs. A ben caratterizzato associata al cancro molecola bersaglio per le diverse strategie di RNAi è ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Questo-trasportatore ABC agisce come una pompa di estrusione di droga e la media "classici" ABCB1-mediata multiresistenza ai farmaci (MDR) fenotipo delle cellule tumorali umane che si caratterizza per un modello specifico resistenza crociata. Diverse ABCB1 che esprimono le cellule tumorali MDR sono stati trattati con anti-ABCB1 espressione vettore shRNA cuscinetto E. coli. Questa procedura ha determinato l'attivazione dei percorsi RNAi all'interno delle cellule tumorali e un regolamento notevole giù del mRNA ABCB1 codifica e la corrispondente pompa di estrusione droga. Di conseguenza, l'accumulazione della droga è stato migliorato nella incontaminata farmaco-resistenti le cellule tumorali e il fenotipo MDR è stata invertita. Per mezzo di questo modello i dati forniscono la proof-of-concept che tk RNAi è adatto per la modulazione di cancro associati fattori, ad esempio ABCB1, nelle cellule tumorali umane.
Protocollo
1) Consegna batterica di shRNAs
- Prima di iniziare con la coltura batterica, si deve preparare LB-media e LB-agar.
- Per la LB-medio pesare estratto di lievito (0,5% w / v), bacto triptone (1,0% w / v) e NaCl (0,6% w / v) e diluire questi componenti in acqua bidistillata. Le soluzioni preparate devono essere sterilizzati in autoclave e sono pronti per l'uso.
- Per LB-agar agar bacto (1,5% w / v) deve essere aggiunto al LB-medium precedente alla sterilizzazione.
- Riscaldare LB-agar nel forno a microonde fino a quando il LB-agar è completamente sciolto. Lasciar raffreddare la soluzione fino a quando la bottiglia può essere toccato con....
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Discussione
Il numero di cellule seminate per le infezioni e il MOI corrispondenti usati, dipendono criticamente sulle linee cellulari sotto osservazione e la loro velocità di crescita. Per trovare il numero di cellule ottimale per la semina, pre-esperimenti per determinare la velocità di crescita sono fortemente raccomandati. Oltre a questo, MOIS diverse dovrebbero essere testati a causa della limitata estendere a cui le cellule possono sopportare l'invasione batterica senza morire di stress. Il punto ottimale di tempo in cui .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato sostenuto dalla concessione nr. 01GU0615 del "Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agar | Biochrom AG | 214050 | |
| Amfotericina B | Biochrom AG | A2612 | |
| Soluzione salina tamponata al fosfato di Dulbecco - PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | Nessun catalogo disponibile, ordine diretto | |
| Gentamicina | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicillina/Streptomicina | Invitrogen GmbH | Contiene 5.000 unità di penicillina (base) e 5.000 μg di streptomicina (base)/ml, utilizzando penicillina G (sale di sodio) e solfato di streptomicina in soluzione salina allo 0,85%. | |
| Cloruro di sodio | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | |
| Estratto di lievito | Difco Laboratories | 212750 |
Riferimenti
- Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells. Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).
- Lage, H.
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Ristampe e permessi
