Qui vi presentiamo l'iniezione intracranica di vettori AAV per la marcatura fluorescente di neuroni e glia nella corteccia visiva.
Abstract
Intracranica iniezione di vettori virali ingegnerizzati per esprimere una proteina fluorescente è una tecnica di etichettatura versatile per la visualizzazione di sottoinsiemi di cellule nelle differenti regioni del cervello sia in vivo che in sezioni cerebrali. A differenza della iniezione di coloranti fluorescenti, etichettatura virale offre targeting di tipi di cellule individuali ed è meno costoso e richiede tempo che stabilire linee di topi transgenici. In questa tecnica, un virale adeno-associato (AAV) vettore viene iniettato intracranially usando le coordinate stereotassica, una micropipetta e una pompa automatica per la consegna precisa AAV alla zona desiderata con minimo danno al tessuto circostante. Parametri di iniezione può essere adattata alle singole sperimentazioni regolando l'età degli animali a velocità di iniezione, la posizione di iniezione, il volume di iniezione, di iniezione, AAV sierotipo e il promotore di guida l'espressione genica. A seconda delle condizioni scelte, virale indotta l'espressione del transgene può permettere la visualizzazione di gruppi di cellule, cellule singole o multa processi cellulari, fino al livello delle spine dendritiche. L'esperimento qui rappresenta una iniezione di AAV a doppio filamento che esprimono la proteina fluorescente verde per l'etichettatura dei neuroni e glia nella corteccia visiva primaria del mouse.
Protocol
1. Virus Manipolazione e stoccaggio Adeguata protezione e le tecniche di manipolazione devono essere scelti in base al livello di biosicurezza del virus da utilizzare. Queste pratiche possono essere trovati in biosicurezza in microbiologiche e Biomedica Laboratori 5 ° edizione, disponibile sul sito del CDC ( http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm ). L'uso di vettori AAV è approvato per la Biosicurezza Live…
Discussion
Virale mediata consegna del gene ha un grande potenziale per lo studio di processi neurologici e trattamento dei disturbi cerebrali 1,2,3. La grande versatilità di questa tecnica può anche essere sfruttato per un'etichetta fluorescente cellule per l'imaging sia in vitro che in vivo4. Qui mostriamo una procedura dettagliata per la trasduzione di neuroni e glia nella corteccia visiva del mouse utilizzando un doppio filamento del virus adeno-associazione che esprime maggiore protei…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato reso possibile da finanziamenti del NIH (EY012977), un Premio alla Carriera nel Scienze Biomediche dal Fondo Burroughs Wellcome, la Fondazione Whitehall, e la Fondazione Sloan (AKM).
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
Stoelting Mouse and Neonatal Rat Adaptor
Stoelting
51625
Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm
Fine Science Tools
14084-08
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved
Fine Science Tools
11152-10
Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled
Fine Science Tools
11251-35
Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm
Fine Science Tools
11000-12
Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece
Ram Products, Inc.
TECH2000ON/OFF
Dental drill
Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter
Fine Science Tools
19008-14
Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul
VWR International/ Drummond
5-000-1001 or 53480-287
Mineral oil
VWR International
29447-338
Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed)
World Precision Instruments, Inc.
M3301-M3-R
Used for determining stereotaxic co-ordinates
UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller
World Precision Instruments, Inc.
UMP3-1
Sutures
VWR International
95056-952
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
Sutter Instruments
P-97
Tobradex
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