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1. Preparazione dei reagenti
- Preparare la preparazione del buffer dissezione aggiungendo i seguenti composti: 128 mM NaCl, 1mM EGTA, 4 mM MgCl 2, 2mM KCl, HEPES 5mm, e 36 mM saccarosio nel 1000 mL, PH a 7,2 e filtro sterilizzare.
2. Preparazione per la dissezione
- Cubo Siligard: Il gel viene tagliato a circa un centimetro di larghezza, 1 pollice di lunghezza e circa 1 cm di altezza. Il cubo di gel viene posto su un vetrino durante la dissezione. Cubi possono essere utilizzati più di una volta.
- Pin: pin utilizzati per la dissezione bisogno di essere più breve. La parte inferiore tagliente di pin minutien funziona meglio in dissezione.
- Bisogno di un forte forbici primavera microdissezione.
- Hai bisogno di due pinze a punta sottile.
3. Raccolta delle larve
- Vagando 3 ° larve instar che stanno esprimendo un tag vescicola proteina GFP sono raccolti su una piastra di Petri.
- Le larve vengono lavati in acqua deionizzata per sbarazzarsi di tutto il cibo.
4. Dissezione dal vivo di larve
- Una larva è trasferito al cubo dissezione gel su un vetrino. Larva è immerso nel buffer dissezione.
- Larva si struggeva al anteriore e posteriore con due perni bene con la parte dorsale fino.
- Utilizzando le forbici microdissezione, un piccolo taglio viene effettuato presso la linea mediana verso la fine posteriore. Da questa incisione è fatta un taglio fino al anteriore. Utilizzando due pin, pin, la cuticola taglio sui bordi laterali.
- Aggiungere una goccia di dissezione buffer. Rimuovere con attenzione l'intestino, intestino e organi di grasso con una pinza. La maggior parte di questi tessuti normalmente fuoriuscita durante il taglio dorsale.
- Sostituire il buffer con fresca tampone dissezione. La larva non deve mai essere asciutto e deve essere costantemente in dissezione buffer.
- Incubazioni utilizzando in vivo MitoTracker marcatori o LysoTracker sono fatte in questo momento, diluendo il marcatore in vivo nel buffer di dissezione. Dopo l'incubazione del marcatore in vivo lavare la larva sezionato diverse volte (5 lavaggi rapido) con ingredienti freschi buffer di dissezione.
- Dopo aver sostituito l'ultimo lavaggio spingere i perni nel syligard e subito coprioggetto. Le larve è ora pronto per l'osservazione.
5. Immagini dal vivo di larve sezionato
- Posizionare il coprioggetto e gel sul palco microscopio e l'immagine utilizzando un microscopio invertito.
- Noi usiamo una lente a 100x vescicole immagine tag all'interno larvale nervi segmentale. Espressione GFP nei corpi delle cellule del ganglio ventrale viene prima valutato prima di nervi segmentali sono ripreso. Se la colorazione GFP robusta è osservata nel corpo cellulare nel ganglio ventrale, i nervi sono poi fotografato e usato per la valutazione.
- Utilizzando un sistema dual vista con filtri per CFP / YFP o RFP / YFP e visualizzare i software divisi possiamo simultaneamente immagine due proteine tag in vivo.
6. Rappresentante Risultati
Figura 1:. Un'immagine rappresentante che mostra molte vescicole assonale su molte piste assonale in un nervo larvale segmentale Notare le macchie di GFP, che rappresentano accumuli assonale.
Figura 2: Una immagine rappresentativa che mostra una singola traccia assonale con molte vescicole assonale all'interno di un nervo larvale segmentale.