La colonia di cellule che formano (CFC) test è un test in vitro in cui progenitori emopoietici formare colonie in terreno semisolido. Una combinazione di morfologia delle colonie, la morfologia delle cellule, e citometria a flusso sono utilizzati per valutare la capacità dei progenitori di proliferare e differenziarsi lungo le varie linee ematopoietiche.
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Articolo metodologico
Formanti colonia cellulare (CFC) Analisi per cellule emopoietiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Umane ematopoietiche staminali / progenitrici sono solitamente ottenute da midollo osseo, sangue del cordone ombelicale, o dal sangue periferico e sono utilizzati per lo studio ematopoiesi e leucemogenesi. Hanno la capacità di differenziarsi in linee linfoidi e mieloidi. La colonia di cellule che formano (CFC) test è usato per studiare la proliferazione e la differenziazione modello di progenitori emopoietici con la loro capacità di formare colonie in un mezzo semisolido. Il numero e la morfologia delle colonie formate da un numero fisso di celle di input fornire informazioni preliminari circa la capacità dei progenitori di differenziarsi e proliferare. Le cellule possono essere raccolte da singole colonie o da tutta la piastra per valutare ulteriormente il loro numero e gli stati di differenziazione in citometria a flusso e la valutazione morfologica di Giemsa vetrini colorati. Questo test è utile per valutare la differenziazione mieloide, ma non linfoidi. Il mieloide termine in questo contesto è usato nel suo senso più ampio fino a comprendere lignaggi granulocitica, monociti, eritroide e megacariociti.
Abbiamo usato questo test per valutare gli effetti di oncogeni sulla differenziazione delle primarie umane cellule CD34 + derivate dal sangue periferico. Per questo scopo sono le cellule trasdotte con entrambi costruire controllo retrovirali o un costrutto che esprime l'oncogene di interesse, in questo caso NUP98-HOXA9. Ci avvaliamo di un vettore retrovirale comunemente usato, MSCV-IRES-GFP, che esprime un mRNA bicistronic che produce il gene di interesse e di un marcatore GFP. Le cellule sono pre-attivate crescendo in presenza di citochine per due giorni prima della trasduzione retrovirale. Dopo altri due giorni, le cellule GFP + sono isolate dalla fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) e mescolato con un metilcellulosa mezzo contenente semisolido integrato con citochine e incubate fino colonie appaiono sulla superficie, in genere 14 giorni. Il numero e la morfologia delle colonie sono documentati. Le cellule vengono poi rimossi dalle piastre, lavato, contati, e sottoposti a citometria a flusso e l'esame morfologico. Citometria a flusso con anticorpi specifici marcatori di superficie della cellula espressi durante emopoiesi fornisce informazioni sulla genealogia e lo stadio di maturazione. Studi morfologici delle singole cellule al microscopio dopo la colorazione di Wright-Giemsa fornire ulteriori informazioni in materia di genealogia e di maturazione. Confronto di cellule trasdotte con controllo vettoriale vuoto a quelli trasdotte con un oncogene rivela gli effetti del oncogene sulla differenziazione ematopoietiche.
Protocollo
1. PREPARAZIONE DEI REAGENTI
- Preparare sterili soluzioni stock 1000x di Fms legati tirosin-chinasi 3 (FLT-3) ligando, granulociti / macrofagi colony-stimulating factor (GM-CSF), fattore della cellula staminale (SCF), trombopoietina (TPO), interleuchina (IL) -3 e IL-6 in base alle istruzioni del produttore. Preparare sterile soluzione madre Retronectin (1mg/ml) anche in base alle istruzioni del produttore. Dividere queste soluzioni madri in piccole aliquote e conservare a -20 ° C per evitare il ripetersi di congelamento e scongelamento.
- Preparare il 2% FBS in IMDM.
- Preparare terreno completo IMDM con concentrazioni finale del 20% FBS, 2 ....
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Discussione
Il dosaggio CFC è stato ampiamente utilizzato per determinare la proliferazione e la differenziazione dei modelli di progenitori emopoietici e per studiare gli effetti di oncogeni (4, 5). Ha il vantaggio rispetto a colture liquide di essere un saggio clonale, tanto che le colonie rappresentano la progenie di un solo progenitore e può essere rimossa singolarmente per ulteriori analisi. La limitazione del dosaggio CFC è che non è adeguata per la rilevazione dei progenitori più immaturi o cellule staminali ematopoietiche, .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Alvin J. Siteman Cancer Center della Washington University School of Medicine e Barnes-Jewish Hospital di St. Louis, MO, per l'utilizzo del core ad alta velocità cell sorter, che ha fornito apparecchiature citometria a flusso e servizi di smistamento. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Borse Salute R01 HL082549 e K02 HL084179 (NRY). Il Siteman Cancer Center è sostenuto in parte da un supporto NCI Cancer Center di Grant P30 CA91842.....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| IMDM | Life Technologies | 12440 | |
| FBS | Stem Cell Technologies | 06150 | |
| L-Glutammina | Life Technologies | 25030 | |
| Penicillina/Streptomicina (PS) | Life Technologies | 15140 | |
| Ligando FLT-3 | PeproTech Inc | 300-19 | |
| GM-CSF | PeproTech Inc | 300-03 | |
| SCF | PeproTech Inc | 300-07 | |
| TPO | PeproTech Inc | 300-18 | |
| IL3 | PeproTech Inc | 200-03 | |
| IL6 | PeproTech Inc | 200-06 | |
| Albumina Sierica Bovina | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
| Retronectina | Takara Bio Inc | T100A | |
| HBSS | Life Technologies | 14175 | |
| PBS | Life Technologies | 14200 | |
| Soluzione di Blu di Tripano (0,4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Methocult GF+ H4435 | Stem Cell Technologies | 04445 | |
| Mezzi Arricchiti di Metilcellulosa Umani | R&D Systems | HSC005 | |
| Colorazione Wright/Giemsa | Harleco | 64571 | |
| Soluzione tampone fosfato, pH 6,4 - formula Giordano | Ricca Chemical Company | 1450 | |
| Metanolo | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 8310 | |
| Siero di topo normale | Rockland Immunochemicals | D208 | |
| Anti-CD11b umano coniugato con fit–eritrina | BD Biosciences | 555388 | |
| Anti-CD33 umano coniugato con allossifocianina | BD Biosciences | 551378 | |
| Anti-CD45 umano coniugato con fit–eritrina-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
| Anti-CD71 umano coniugato con fit–eritrina | BD Biosciences | 555537 | |
| Anti-CD235a umano coniugato con allossifocianina | BD Biosciences | 551336 | |
| Anti-CD45 umano coniugato con fit–eritrina-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
| Piastre per colture cellulari non trattate da 24 pozzetti | BD Biosciences | 35-1147 | |
| Piastra non trattata da 30 mm | Stem Cell Technologies | 27150 | |
| Piastra per colture cellulari da 100 mm | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Piastre graduate per conteggio | Stem Cell Technologies | 27500 | |
| Provette da centrifuga da 15 ml | BD Biosciences | 35-2097 | |
| Provette da centrifuga da 50 ml | BD Biosciences | 35-2070 | |
| Siringhe da 3 ml | Stem Cell Technologies | 28240 | |
| Ago ottuso da 16 gauge, lunghezza 1½ pollice | Stem Cell Technologies | 28110 | |
| Filtro cellulare CellTrics da 50 μm | Partec | 04-004-2327 | |
| Emocitometro | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Camere campione TPX | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A78710018 | |
| Vetrini microscopici Fisherbrand Superfrost/Plus, pre-puliti | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Schede filtro Shandon | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5991022 | |
| Porta-vetrini Shandon per citospin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 59920063 | |
| Assemblaggio completo per colorazione Shandon 100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| Carta filtro da 1 μm | VWR international | 28307-134 | |
| Microscopio invertito | Nikon Instruments | Diaphot | |
| Telecamera per microscopio | Nikon Instruments | DS-F11 | |
| Microscopio | Olympus Corporation | BX51 | |
| Telecamera per microscopio | Olympus Corporation | DP71 | |
| Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | |
| Mixer vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Incubatore per colture cellulari | Sanyo | MCO-18AIC | |
| Citospin | Shandon, Inc. | Cytospin 2 | |
| Centrifuga da banco | Eppendorf | 5810-R | |
| Sistema di purificazione dell'acqua | Barnstead | Nanopure-Diamond |
Riferimenti
- Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R.
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Ristampe e permessi
