Determinazione del numero delle cellule durante coltura cellulare utilizzando il contatore di cellule Scettro

Sommario

Il contatore di cellule Scettro è un dispositivo portatile automatizzato che può essere usato per contare le celle, monitorare diametro delle cellule e il volume, e possono essere usate per controllare la salute e la qualità di popolazioni cellulari da una cultura all'altra.

Abstract

Conteggio delle cellule è spesso un passo necessario, ma noioso per la coltura cellulare in vitro. Le concentrazioni di cellule coerente garantire la riproducibilità sperimentale e precisione. Conta delle cellule sono importanti per monitorare la salute delle cellule e tasso di proliferazione, valutando immortalizzazione o trasformazione, per la successiva semina cellule esperimenti, trasfezione o infezione, e prepararsi per saggi cellulari. E 'importante che conta delle cellule essere precisi, coerenti e rapidi, in particolare per le misure quantitative di risposte cellulari.

Nonostante questa esigenza di velocità e la precisione nel conteggio delle cellule, il 71% di 400 ricercatori hanno esaminato ¹ che contare le celle con un emocitometro. Mentre hemocytometry è poco costoso, è laborioso e soggetto a bias di utenti e abuso, che si traduce nella conta inesatti. Hemocytometers sono realizzati in speciale vetro ottico su cui sono caricati sospensioni cellulari in volumi specificati e contati al microscopio. Fonti di errori in hemocytometry includono: distribuzione disomogenea delle cellule nel campione, troppe o troppo poche cellule nel campione, le decisioni soggettive sul fatto che una data cellula rientra nel settore di conteggio definita, la contaminazione del emocitometro, utente-utente variazione , e la variazione del tasso di riempimento emocitometro ^2.

Per alleviare la noia associati a conteggio manuale, il 29% dei ricercatori contare le celle con il conteggio delle cellule automatizzate dispositivi, questi comprendono visione basati su contatori, sistemi che rilevano le cellule utilizzando il principio Coulter, o citometria a flusso ^1. Per la maggior parte dei ricercatori, il principale ostacolo all'utilizzo di un sistema automatizzato è il prezzo associato a queste grandi strumenti da banco ^1.

Il contatore di cellule Scettro è un dispositivo automatico portatile che offre l'automazione e la precisione del conteggio Coulter ad un costo relativamente basso. Il sistema utilizza il principio Coulter di impedenza a base di rivelazione di particelle ³ in un formato miniaturizzato utilizzando una combinazione di hardware analogico e digitale per il rilevamento, elaborazione del segnale, la memorizzazione dei dati e visualizzazione grafica. La punta di usa e getta è stato progettato con un microfabbricazione, cellula di rilevamento zona che permette la discriminazione in base alle dimensioni delle cellule e il volume delle cellule a livello sub-micron e sub-picolitri risoluzione. Avanzata con precisione liquido di gestione dei canali e l'elettronica, il contatore di cellule Scettro report statistici popolazione di cellule visualizzati graficamente come un istogramma.

Protocollo

1. L'importanza della conta cellulare

1. Conteggio delle cellule è un passo necessario, ma noioso per la coltura cellulare in vitro.
2. Le concentrazioni di cellule coerente garantire la riproducibilità sperimentale e precisione.
3. Conta delle cellule sono importanti per monitorare la salute delle cellule e tasso di proliferazione, valutando immortalizzazione o trasformazione, per la successiva semina cellule esperimenti, trasfezione o infezione, e prepararsi per saggi cellulari.
4. Nonostante la necessità di velocità e la precisione nel conteggio delle cellule, il 71% di 400 ricercatori hanno esaminato le cellule contare utilizzando un emocitometro. Mentre hemocytometry è poco costoso, è laborioso e soggetto a bias di utenti e abuso, che si traduce nella conta inesatti.
5. Fonti di errore in hemocytometry includono: distribuzione disomogenea delle cellule nel campione, troppe o troppo poche cellule nel campione, le decisioni soggettive se una data cellula rientra nel settore di conteggio definita, la contaminazione del emocitometro, utente-utente variazione , e la variazione del tasso di riempimento emocitometro.
6. Per alleviare la noia associati a conteggio manuale, il 29% dei ricercatori contare le celle con dispositivi automatizzati conteggio delle cellule. Tuttavia, per la maggior parte dei ricercatori, il prezzo associati a questi grandi strumenti da banco è una barriera al loro utilizzo.
7. Il contatore di cellule Scettro è un dispositivo automatico portatile che offre l'automazione e la precisione del conteggio Coulter ad un costo relativamente basso.
8. Il sistema utilizza il principio Coulter di impedenza a base di rivelazione di particelle in un formato miniaturizzato utilizzando una combinazione di hardware analogico e digitale per il rilevamento, elaborazione del segnale, l'archiviazione dei dati e visualizzazione grafica.
9. Il sensore usa e getta è stato progettato con un microfabbricazione, cellula di rilevamento zona che permette la discriminazione in base alle dimensioni delle cellule e il volume delle cellule a livello sub-micron e sub-picolitri risoluzione.
10. Avanzata con precisione liquido di gestione dei canali e l'elettronica, il contatore di cellule Scettro visualizza graficamente le statistiche sulla popolazione cella come un istogramma.

2. Preparazione di una singola cellula Sospensione conteggio

1. Per utilizzare il contatore di cellule Scettro, inizia diluendo un'unica sospensione di cellule, in soluzione salina tamponata con fosfato. Una concentrazione di 10,000-500,000 cellule per ml è ottimale.
2. Trasferire 100 ml di cellule diluito in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml.

3. Esecuzione di conteggio delle cellule usando lo Scettro

1. Accendere il contatore di cellule Scettro tenendo premuto la leva sul retro dello strumento ed attendere la istruzioni sullo schermo ad apparire.
2. Quando richiesto, collegare un sensore per la fine dell'unità Scettro con il pannello di elettrodi di rilevamento rivolto verso la parte anteriore dello strumento.
3. Sensori scettro composto da una camera di stampaggio di precisione di campionamento, con una zona di rilevamento elettronico e integrato delle cellule-sensing elettrodi. I sensori consentono di discriminare le dimensioni delle cellule a livello sub-micron di risoluzione, e il volume delle cellule a livello sub-picolitri risoluzione.
4. Ingegneria sensore coerente, assicura che i volumi di campione pari sono contati e la misurazione delle dimensioni accurate sono fatti.
5. Una volta che il sensore è collegato, eseguire ogni passaggio del processo di conteggio in base alla istruzioni sullo schermo come segue:
6. Quando lo schermo si legge "Tenere premuto lo stantuffo per iniziare," spingere il pistone. Lo schermo sarà quindi leggere "immergere il sensore." Immergere il sensore nella soluzione sospensione cellulare e rilasciare lo stantuffo per aspirare la sospensione cellulare nel sensore.
7. Il pistone agisce come un segnale elettrico e prelevare il campione di più volume morto nel sensore. La velocità o la precisione di immergersi non importa come fa con pipettaggio. Questo processo richiederà alcuni secondi. Quando è pronto, lo strumento emette un segnale acustico, e "Sample caricati" sarà visualizzato sullo schermo.
8. Una volta che il campione è caricato nel sensore lo ha emesso, attraverso la zona di rilevamento per valutare le dimensioni delle cellule e il volume delle cellule, poi attraverso il microcanali. Il 50 l di campione è contato il sensore dice lo strumento per fermare il conteggio.
9. Dopo il conteggio è completa, lo schermo dello strumento leggerà "Count completa. Rimuovere sensore e scartare". Seguire le operazioni, e rimuovere ed eliminare il sensore.
10. Lo strumento quindi visualizzare un istogramma della dimensione della cella o diametro sullo schermo così come la concentrazione di cellule per ml.

4. Analisi dei dati

1. Dopo il conteggio è completa e l'istogramma viene visualizzato sullo strumento, si applicano cancelli premendo il pulsante di commutazione. Selezionare "gating auto" o "ultimo uso" per impostare in modo automatico la porta in base al profilo istogramma, o di utilizzare le porte dal conteggio precedente.
2. Indipendentemente dalla scelta, le porte possono essere spostati manualmente per mettere a punto i dati. Premere il pulsante di passare nuovamente per selezionare il cancello di sinistra e di far scorrere laggle per spostare il cancello come desiderato.
3. Quindi premere il passare nuovamente per attivare la porta a destra e scorrere la leva per posizionare il cancello giusto. Clicca di nuovo, una nuova concentrazione delle cellule, volume medio delle cellule e diametro sarà visualizzato.
4. La ginocchiera può anche essere spostata su entrambi i lati per passare il display tra data, ora, dimensione media delle cellule, ed il volume medio delle cellule.
5. Fino a 72 istogrammi possono essere memorizzati sullo strumento stesso. Per caricare i dati ad un personal computer, collegare lo strumento tramite la porta cavo USB sul display.
6. Sul PC, fare doppio clic sul software applicativo Scettro per lanciare il software, quindi fare clic su "connect". Tutti i conteggi si porta automaticamente al software.
7. Il Software applicativo Scettro visualizza l'istogramma che ripartisce popolazione della cultura in volume o diametro. I file scaricati possono essere esportati in Microsoft Excel, dove i dati grezzi vengono visualizzati in contenitori di diametro cella specificata o volumi cellulari.

5. Rappresentante Risultati

1. Diciannove diverse linee cellulari sono stati preparati per il conteggio e teorici delle concentrazioni di partenza sono stati determinati utilizzando un contatore Coulter. Queste sospensioni cellulari sono state poi ulteriormente diluito per ottenere sospensioni cellulari a concentrazioni cellulari teorica.
2. Il contatore di cellule Scettro è stato poi utilizzato per determinare le concentrazioni cellulari. La figura 1 mostra 5 diluizioni che sono stati misurati per 5 linee di cellule rappresentante insieme alla concentrazione cellulare teorica.
3. L'elevato grado di linearità come indicato dai valori di R2, dimostra che il conteggio Scettro è un metodo affidabile per le linee cellulari testate, attraverso una vasta gamma di funzionamento lineare.
4. L'accuratezza complessiva relativa di conteggio Scettro è dimostrato nella figura 2, in cui vengono confrontati i dati ottenuti dal conteggio Scettro con conteggi ottenuti da Counting Coulter.
5. Il registro di conta delle cellule Scettro è in funzione del log dei conteggi Coulter, e dimostra che, in tutte le linee cellulari testate, conta Scettro corrispondere conta Coulter.
6. Conta di 19 linee cellulari sono state effettuate utilizzando un Z2 Coulter Counter, il contatore di cellule Scettro, un contatore automatico visione basata, come Vi-Cell o sistema Innumerevoli, e un hemocytemeter.
7. Conteggi sono stati eseguiti secondo le istruzioni del produttore, utilizzando la stessa cellula di partenza sospensione e diluizioni identici. I risultati mostrati in Figura 3 dimostrano che le concentrazioni misurate dal cellulare Scettro contando strettamente corrispondere concentrazioni di cellule teorica con elevata linearità.
8. Il coefficiente di variazione percentuale, o CV, è stato calcolato per ogni diluizione di ciascuna linea cellulare per ogni sistema di conteggio. La Figura 4 mostra il CV% medio di oltre 19 linee di cellule rispetto alla concentrazione cellulare e metodo di conteggio.
9. All'interno della gamma di funzionamento, il contatore di cellule Scettro è più preciso conteggio emocitometro visione basata, mostrando piccole deviazioni standard e piccoli coefficienti medi di variazione.
10. Conteggio scettro è dieci volte più veloce hemocytometry e più velocemente di altri sportelli automatici troppo. Nella Figura 5, SF9, MCF7, e cellule HEK293 sono state contate utilizzando i metodi descritti in questo video.
11. Il tempo medio necessario per misurare la concentrazione cellulare è stato registrato. Si noti che hemocytometry è stata eseguita una sola volta per ogni campione.
12. Scettro effettua misurazioni in base alle dimensioni della cella. Così qualsiasi eventuale cambiamento morfologico cellulare possono essere catturati nell'istogramma. Culture sano visualizzare un bel distribuzione gaussiana a forma di campana, mentre le cellule malsane, lisare, e provocare un cambiamento nel istogramma a sinistra (Figura 6, pannello a sinistra).
13. Allo stesso modo, quando una popolazione pari al 50% cellule morte sono state mescolate con 50% di cellule vive, si sposta istogramma sono stati anche osservati (Figura 6, pannello di destra).

Discussione

Confrontando le prestazioni del contatore di cellule Scettro ai risultati di altri metodi di conteggio, possiamo concludere che questo nuovo portatile, contaglobuli automatizzato offre conta delle cellule preciso, veloce e affidabile in un ampio campo di funzionamento. La funzionalità di conteggio Scettro è il risultato della tecnologia di precisione costruita incorporato nella punta del sensore e la strumentazione sofisticata conteggio basato sul principio Coulter. La qualità delle prestazioni suggerisce Scettro contare come metodo per aumentare la velocità e migliorare la riproducibilità dei saggi cellulari. Il formato palmare permette noia veloce destra libera conteggio al cofano colture cellulari.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commento
Scettro 2,0 contatore portatile cella automatizzata con sensori micron 40 Scettro	EMD Millipore	PHCC20040
Scettro 2,0 contatore portatile cella automatica con 60 sensori Scettro micron	EMD Millipore	PHCC20060
Sensori scettro, 60 micron	EMD Millipore	PHCC60050	50 Pack di sensori
Sensori scettro, 40 micron	EMD Millipore	PHCC40050	50 Pack di sensori
Universal Power Adapter	EMD Millipore	PHCCPOWER
Scettro O-Ring Kit	EMD Millipore	PHCCOCLIP	2 O-ring e un coperchio del filtro