Forniamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule primarie dissociata dalla Drosophil Un embrioni. La possibilità di effettuare la perturbazione efficace RNAi, insieme ad altri metodi di imaging molecolare, biochimici e cellulari che permette ad una serie di questioni da affrontare in Drosophila Cellule primarie.
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Articolo metodologico
Colture cellulari primarie da Drosophila Gastrula embrioni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Qui si descrive un metodo per la preparazione e la coltura di cellule primarie dissociato da embrioni di Drosophila gastrula. In breve, una grande quantità di embrioni in scena dalle mosche giovani e sani sono raccolti, sterilizzati, e poi fisicamente dissociato in una sospensione singola cella utilizzando un omogeneizzatore di vetro. Dopo essere stato placcato su piastre di coltura o le diapositive da camera alla densità adeguata nel terreno di coltura, queste cellule possono ulteriormente differenziarsi in diversi tipi di cellule-morfologicamente distinte, che possono essere identificati dal loro marker cellulari specifici. Inoltre, vi presentiamo le condizioni per il trattamento di queste cellule a doppia elica (ds) RNA a suscitare knockdown gene. RNAi in cellule di Drosophila efficiente primaria si ottiene semplicemente fare il bagno le cellule in dsRNA contenenti terreno di coltura. La capacità di effettuare efficaci perturbazione RNAi, insieme ad altri molecolare, biochimica, analisi di imaging cellulare, permetterà una serie di domande a cui rispondere in cellule di Drosophila primarie, in particolare quelli relativi alla muscolari differenziate e cellule neuronali.
Protocollo
1. Preparazione di gabbie volare
- Crescono Drosophila (ceppi wild-type come Rimini-R o qualsiasi genotipo) in contenitori utili come 32-oz tazze insetti.
- Trasferimento di nuova eclosed vola a grandi embrio-raccolta gabbie o gabbie volare popolazione.
- Spostare le gabbie in una stanza con una temperatura di circa 25 ° C e umidità ~ 65% in una luce di 12 ore e una scura 12-h ciclo per facilitare la raccolta di embrioni sincrono.
- Mantenere le mosche nelle gabbie somministrando loro uccisi pasta lieviti striato su piatti melassa. Cambiare le piastre melassa (con pasta di lievito uccisi) una volta al giorno per 2-3 d. <....
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Discussione
Il modello di sviluppo di colture primarie di cellule di Drosophila può variare notevolmente, probabilmente a causa delle diverse variabili durante il processo di preparazione delle cellule primarie. Prima di tutto, vola per la posa delle uova devono essere giovani (entro una settimana di vita) e sano (privo di infezione virale o batterica). Embrioni non fecondati o infette devono essere evitati, in quanto sono inutili e le cellule derivate da questi embrioni non possono differenziare e potrà sopravvivere solo .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
JB è stato sostenuto dal Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship DRG-1716-02. JZ è stato sostenuto da NIH / NIGMS Fellowship GM082174 F32-02. NP è un investigatore del Howard Hughes Medical Institute.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Mezzo M3 di Shields e Sang | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Serum bovino fetale | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulina da pancreas bovino | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Gabbie grandi per il prelievo di embrioni | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Setaccio standard USA #25 | VWR international | 57334-454 | |
| Setaccio standard USA #45 | VWR international | 57334-462 | |
| Setaccio standard USA #120 | VWR international | 57334-474 | |
| Macina tessuti Dounce, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Macina tessuti Dounce, Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Macina tessuti Dounce, Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Piastra Costar a 384 pozzetti | VWR international | 29444-078 | |
| Coprioggetti con camere Lab-Tek II | Fisher Scientific | 171080 |
Riferimenti
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elong....
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Ristampe e permessi
