Un protocollo per l'isolamento e l'attivazione di spermatidi da maschio C. elegans È descritto qui. Taglio alla fine posteriore del maschio spermatidi release. Il spermatidi può essere attivato con l'aggiunta di proteasi.
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Articolo metodologico
Isolamento e In vitro Attivazione di Caenorhabditis elegans Sperm
In questo articolo
Sommario
Abstract
Maschi e ermafroditi sono le due forme naturalmente trovato sessuale nel nematode C. elegans. Lo sperma ameboidi sono prodotte da entrambi i maschi e ermafroditi. Nella prima fase della gametogenesi, le cellule germinali di ermafroditi differenziarsi in un numero limitato di spermatozoi - circa 300 - e sono memorizzati in una piccola 'borsa' chiamata spermateca. Più tardi, ermafroditi continuamente produrre ovociti 1. Al contrario, i maschi producono esclusivamente spermatozoi per tutta la loro età adulta. I maschi producono spermatozoi così tanto che rappresenta> 50% delle cellule totali in un tipico 2 verme adulto. Pertanto, isolare gli spermatozoi dei maschi è più facile che da quella di ermafroditi.
Solo una piccola percentuale di maschi sono naturalmente generati grazie alla spontanea non disgiunzione del cromosoma X 3. Crossing ermafroditi con i maschi o più comodamente, l'introduzione di mutazioni a dare origine a Lui (alta incidenza di maschi) fenotipo sono alcune delle strategie attraverso cui si può arricchire la popolazione maschile 3.
I maschi possono essere facilmente distinto da ermafroditi osservando i 4 morfologia coda. Coda ermafrodita è puntato, mentre la coda di sesso maschile è completato con le strutture di accoppiamento.
Taglio della coda rilascia vasto numero di spermatidi memorizzati all'interno del tratto riproduttivo maschile. La dissezione viene eseguita al microscopio stereo utilizzando aghi calibro 27. Dal momento che spermatidi non sono fisicamente connessi ad eventuali altre cellule, la pressione idraulica espelle contenuti interni del corpo maschile, tra cui spermatidi 2.
I maschi sono direttamente dissezionato in una piccola goccia di 'Medium sperma'. Spermatidi sono sensibili a variazioni del pH. Quindi, HEPES, un composto con una buona capacità tampone viene utilizzato nei media sperma. Glucosio e altri sali in ambiente sperma aiutare a mantenere la pressione osmotica per mantenere l'integrità degli spermatozoi.
Post-meiotico differenziazione delle spermatidi in spermatozoi è chiamato spermiogenesi o l'attivazione dello sperma. Scuote 5, 6 e Nelson precedentemente dimostrato che l'spermatidi possono essere indotte a differenziarsi in spermatozoi con l'aggiunta di composti tra cui l'attivazione di vari pronasi E. Qui mostriamo in vitro spermiogenesi di C. spermatidi elegans utilizzando pronasi E.
Spermiogenesi successo è pre-requisito per la fertilità e quindi i mutanti difetti di spermiogenesi sono sterili. Finora molti mutanti hanno dimostrato di essere difettoso in particolare nel processo di spermiogenesi 7. Anomalie rilevate durante l'attivazione in vitro di nuovi Spe (spermatogenesi difettoso) mutanti ci aiuterebbe a scoprire i giocatori aggiuntivi che partecipano a questo evento.
Protocollo
1) Arricchimento della popolazione maschile
- A seconda delle esigenze sperimentali, un gran numero di maschi possono essere ottenuti utilizzando una delle seguenti strategie:
- vasta popolazione di maschi di tipo selvatico possono essere ottenuti incrociando 5 maschi e 1 wild-type ermafrodita su un piccolo prato di OP50 testa di serie al centro del piatto NGM. Circa il 50% della generazione successiva sarà maschi wild-type.
- lui-5 (e1490) o lo-8 (e1489) ermafroditi gettare gran numero di maschi. lui-5 e lo-8 maschi sono fertili e non ci sono difetti evidenti nella morfologia degli spermatozoi e la funzione....
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Discussione
Oltre ad analizzare mutanti Spe, questo protocollo ha altre importanti applicazioni, quali l'analisi della morfologia degli spermatozoi con l'invecchiamento. Spermatidi e spermatozoi isolati utilizzando questo protocollo può essere utilizzato in altri esperimenti a valle, come, immunocolorazione di tipo selvatico e sperma mutante 8, 9, la motilità degli spermatozoi nelle diapositive 10, misurazioni fisiologiche 9, 11, o anche l'inseminazione artificiale 12.
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo Samuel Ward, Diane C. Shakes e Gregory Nelson pionieristico per questa tecnica. Ringraziamo Pavan Kadandale e Brian Geldziler di video che mostrano gli spermatozoi attivi, i membri del laboratorio Singson per le discussioni utili; CGC per i ceppi e NIH per averci sostenuto con borsa (R01HD054681).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa per tubercolina | BD Biosciences | 309623 | Siringa: 1 ml, ago: 27G X ½ in |
| Penna Pap | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| Vetrini microscopici VWR VistaVision HistoBond | VWR international | 16004-406 | Dimensioni: 75X25X1mm |
| Vetrino coprioggetto | VWR international | 48366045 | |
| Proteasi | Sigma-Aldrich | P-6911 |
Riferimenti
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. Methods ....
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Ristampe e permessi
